采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

胸苷酸合成酶在涎腺肌上皮细胞中的表达和临床意义

目的 研究胸苷酸合成酶（TS）在涎腺肌上皮细胞中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化 EnVision 法检测TS、p63、Calponin、CK5/6、S-100在32例不同类型涎腺病变组织中的表达,包括非肿瘤性和涎腺炎性样本10例、混合瘤样本11例、基底细胞癌样本5例和腺样囊性癌样本6例。评估TS作为涎腺肌上皮细胞特异性分子标志的特异性、敏感性。结果 TS在各种涎腺组织中的表达模式与P63的表达完全一致,均能在涎腺肌上皮细胞中呈清晰的胞核型强阳性表达;同时,Calponin、CK5/6、S-100在涎腺肌上皮细胞中呈质/膜型阳性表达;此外,TS在少数涎腺腺上皮细胞、癌细胞和散在的少数间质细胞胞浆中呈弱阳性或中等 强度阳性表达,但在细胞核中呈阴性表达。统计学分析结果显示TS在涎腺肌上皮细胞中的表达与p63、Calponin、CK5/6、S-100具有高度一致性（P>0.05）,除与CK5/6在涎腺炎和涎腺组组表达比较之外,Kappa>0.75,且具有100%的特异性和敏感性。结论 胸苷酸合成酶可作为一种新的特异性涎腺肌上皮细胞标志物,并用于涎腺肿瘤的诊断和鉴别诊断。     

特发性肠系膜静脉肌内膜增生症临床病理特征观察及文献回顾

目的 探讨特发性肠系膜静脉肌内膜增生症临床病理特征。方法 收集1例少见的特发性肠系膜静脉肌内膜增生症,通过回顾临床信息、组织形态特点,复习国内外相关文献,总结其临床病理特征。结果 患者女性,30岁,间断性右下腹痛6个月余。以克罗恩病治疗无效,随后手术切除右半结肠。术前活检见固有层纤维素沉积及黏膜下层“动脉化”毛细血管;手术标本发现肠系膜侧显著的中小静脉肌内膜增生,部分静脉腔显著狭窄或闭塞,弹力纤维染色提示内膜下弹力纤维增生紊乱,考虑特发性肠系膜静脉肌内膜增生。结论 特发性肠系膜静脉肌内膜增生症是一种少见的缺血性结肠炎,确诊依赖手术标本肠系膜中小静脉肌内膜的增生,活检标本内皮下纤维蛋白沉积和毛细血管“动脉化”或可帮助诊断。     

地尔硫卓通过下调钙激活氯离子通道抑制肝癌细胞增殖和运动

目的观察钙离子通道抑制剂地尔硫卓对肝癌MHCC97H、7402细胞增殖和运动侵袭能力的作用,探讨其相应机制。方 法采用不同浓度地尔硫卓（0、25、50、100、200、400 μmol/L）干预肝癌MHCC97H、7402细胞不同时间（12、24、48 h）后,用MTT 法测定地尔硫卓对肝癌细胞增殖的影响,体外细胞划痕实验检测处理后肝癌细胞运动侵袭能力;通过RT-PCR和免疫细胞化学 检测地尔硫卓对肝癌细胞中TMEM16A mRNA和蛋白表达水平的影响。结果地尔硫卓能够有效抑制肝癌MHCC97H、7402 细胞的增殖和运动侵袭能力,且具有一定的时间和浓度依赖性特点（P<0.05）。其中,100 μmol/L浓度的地尔硫卓作用24 h对 MHCC97H肝癌细胞抑制较明显,TMEM16AmRNA和蛋白表达减少（P<0.05）,而50 μmol/L浓度的地尔硫卓作用48 h对7402 肝癌细胞抑制较明显,TMEM16AmRNA和蛋白表达减少（P<0.05）。结论地尔硫卓能一过性抑制MHCC97H、7402肝癌细胞 侵袭,这种作用可能与其通过调节钙离子通道TMEM16A的mRNA和蛋白表达而发挥肿瘤抑制作用有关。     

地尔硫卓上调异黏蛋白在肝癌细胞中的表达

目的研究钙离子通道抑制剂逆转肝癌细胞多药耐药和对异黏蛋白表达的影响及分子机制。方法采用不同浓度钙离子 抑制剂（0、25、50、100、200、400 μmol/L）干预肝癌MHCC97H、7402细胞不同时间（12、24、48 h）后,用体外细胞划痕实验检测处 理后肝癌细胞运动迁徙能力;采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测钙离子抑制剂对肝癌细胞中P-gp和异黏蛋白的表达的影 响。结果钙离子抑制剂能够一过性抑制肝癌MHCC97H、7402 细胞的迁徙运动能力,且具有一定的时间和浓度依赖性特点 （P<0.05）。同时,不同浓度钙离子抑制剂盐酸地尔硫卓均能一过性上调肝癌MHCC97H、7402细胞中异黏蛋白mRNA和蛋白的 表达（P<0.05）,但并不抑制P-gp蛋白的表达。结论钙离子抑制剂地尔硫卓能一过性抑制MHCC97H、7402肝癌细胞的迁徙运 动,并能反馈性上调促癌基因异黏蛋白mRNA和蛋白的表达水平。因而,采用钙离子抑制剂很可能具有增加肿瘤进展的潜在风险。