人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

磁标记反义探针对小鼠的急性毒理观察

目的 评价SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对小鼠的急性毒性,为进一步将该探针用于活体MR基因成像与靶向基因治疗奠定基础.方法 60只清洁级昆明种小鼠分为口服灌胃、静脉注射、腹腔注射3组,采用最大给药苗法,口服灌胃:总剂量为2 104.8 mg/kg,给药容积40 ml/kg;静脉注射:总剂量为438.5 mg/kg,给药容积25 ml/kg;腹腔注射:总剂量为1 578.6 mg/kg,给药容积30 ml/kg;各组还另设20只小鼠按相应方式给予等量生理盐水作为对照.所有实验小鼠均在25℃室温下连续饲养14 d,观察并记录饲养期问小鼠的一般情况、主要脏器的病理学、血常规、凝血指标和血清主要生化指标改变.结果 在观察期间,各组小鼠均末出现死亡,仅个别出现食欲下降、饮水量增多、腹泻、嗜睡、活动增加等,但均在3 d内恢复正常.脏器系数无统计学差异,肝、脾、肾、心、肺、骨髓、生殖器等主要脏器颜色、形态未见明显异常改变,HE染色切片肝、脾、肾、心、肺、生殖器等细胞和Wright染色的骨髓细胞均无水肿、变性、坏死等改变,普鲁士蓝染色仅见肝、脾内分布少许监色铁颗粒.各组血常规、凝血指标及生化指标无统计学差异.结论 SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对小鼠无急性毒性.     

抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定

目的从噬菌体抗体库中筛选抗CCR7单链融合抗体,并对其生物学特性进行初步检测。方法PCR检测大肠杆菌中ScFv基因插入率;琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;分别以乳腺癌细胞及CCR7多肽片段为靶抗原对抗体库进行4轮和3轮筛选富集。将阳性克隆转化E.coliHB2151进行可溶表达。抗体亲和层析纯化后,经Western blot鉴定,通过ELISA法检测可溶性ScFv抗体的免疫活性。免疫细胞化学和放射免疫显像鉴定scFv抗体与乳腺癌细胞结合的特异性。结果ScFv基因插入率为90%(18/20),双酶切鉴定检测到目的条带。经4轮细胞筛选,3轮抗原筛选抗CCR7抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,在E.coliHB2151中实现可溶表达。Western blot结果显示获得抗体相对分子质量为34ku左右。免疫细胞化学检测与放射免疫显像均证实单链抗体与表达CCR7的乳腺癌细胞MDA-MB-435s特异性结合。结论成功从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗CCR7单链抗体。抗体在体内体外均与肿瘤细胞表达特异抗原结合。     

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选肺腺癌细胞A549特异性单链抗体。方法利用肺腺癌患者癌旁淋巴结组织构建肺腺癌噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别A549细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化E．coliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS—PAGE、Westernblot鉴定,通过ELISA法鉴定其与人肺腺癌细胞结合的特异性。结果成功构建了1个4．6×10^7的噬菌体抗体库。在筛选过程中,肺腺癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第5轮为第1轮的181倍。在E．coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS—PAGE与Westernblot结果显示抗体相对分子质量为30×10^3左右。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与A549细胞结合,而不与MDA—MB-435细胞结合。结论从肺腺癌病人癌肿周围淋巴结扩增免疫球蛋白基因成功地构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到肺腺癌特异性抗体。     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

~(131)I标记抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌体抗体在荷瘤裸鼠体内的分布及其对肿瘤生长的抑制作用

目的研究抗Peroxiredoxin I(PrxI)肺腺癌相关单链抗体体外对肺腺癌细胞的增殖抑制;观察131I标记抗体在肺腺癌裸鼠模型体内分布、靶向显像及体内抑瘤作用。方法放射性核素计数法测定单链抗体细胞内摄水平;MTT法及流式细胞仪检测单链抗体抑制肺腺癌A549细胞生长情况;免疫印迹法检测单链抗体作用于A549细胞后对细胞内PrxI表达水平的影响。放射性核素131I标记纯化抗体,进行荷瘤裸鼠体内分布、SPECT放免显像及病理切片观察抑瘤作用。结果单链抗体干预后细胞PrxI蛋白表达水平较对照组下降(P<0.05)。体内分布研究表明单链抗体与肺腺癌组织有效结合。荷瘤裸鼠尾静脉注射131I标记抗体48h后,瘤/血和瘤/肌肉放射性比值均达到最大值4.06±0.13和5.17±0.97。SPECT示抗体注射后48hT/NT值明显高于12h、24h和72h(F均>86,P均<0.01)。治疗4周后,131I标记抗体治疗组肿瘤体积为(0.68±0.17)cm3,质量为(1.58±0.21)g,抑瘤率56.8%,与对照组比较有统计学差异。结论抗PrxI肺腺癌单链抗体能有效抑制肺腺癌细胞生长,131I标记单链抗体在体内能抑制...     

131Ⅰ标记抗PeroxiredoxinⅠ肺腺癌噬菌体抗体在荷瘤裸鼠体内的分布及其对肿瘤生长的抑制作用

目的 研究抗Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)肺腺癌相关单链抗体体外对肺腺癌细胞的增殖抑制;观察131I标记抗体在肺腺癌裸鼠模型体内分布、靶向显像及体内抑瘤作用.方法 放射性核素计数法测定单链抗体细胞内摄水平;MTT法及流式细胞仪检测单链抗体抑制肺腺癌A549细胞生长情况;免疫印迹法检测单链抗体作用于A549细胞后对细胞内Prx Ⅰ表达水平的影响.放射性核素131Ⅰ标记纯化抗体,进行荷瘤裸鼠体内分布、SPECT放免显像及病理切片观察抑瘤作用.结果 单链抗体干预后细胞Prx Ⅰ蛋白表达水平较对照组下降(P＜0.05).体内分布研究表明单链抗体与肺腺癌组织有效结合.荷瘤裸鼠尾静脉注射131Ⅰ标记抗体48 h后,瘤/血和瘤/肌肉放射性比值均达到最大值4.06±0.13和5.17±0.97.SPECT示抗体注射后48 h T/NT值明显高于12 h、24 h和72 h(F均＞86,P均＜0.01).治疗4周后,131Ⅰ标记抗体治疗组肿瘤体积为(0.68±0.17)cm3,质量为(1.58±0.21)g,抑瘤率56.8%,与对照组比较有统计学差异.结论 抗Prx Ⅰ肺腺癌单链抗体能有效抑制肺腺癌细胞生长,131I标记单链抗体在体内能抑制肿瘤生长.     

抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的筛选及其在荷瘤裸鼠体内的分布

目的：通过对已构建的肺腺癌相关人源单链抗体库进行筛选,得到抗过氧化物酶Peroxiredoxin Ⅰ (Prx Ⅰ）肺腺癌单链抗体,评价抗体在动物模型体内分布及靶向显像作用。方法：PCR法检测大肠杆菌TG1中单链抗体single-chain variable fragment (scFv) 基因插入率;凝胶电泳鉴定Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切质粒结果;以肺腺癌细胞株A549和在肺癌中高表达的抗氧化蛋白Prx Ⅰ为靶抗原,对抗体库进行富集筛选。阳性克隆用IPTG诱导表达并检测。放射性核素131I标记纯化抗体,进行荷瘤裸鼠体内分布及SPECT放射免疫显像研究。结果：scFv基因插入率为77%（23/30）,双酶切鉴定证实目的条带。通过亲和筛选,肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮是第1轮的180倍。选取10个克隆经ELISA法检测,其中6个克隆与A549细胞呈阳性反应,阳性率60%（6/10）。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗Prx Ⅰ肺腺癌单链抗体。竞争ELISA显示抗〖JP3〗体能有效结合A549细胞。核素标记抗体的放射化学纯度为(95.6±3.7)%,比活度为(2.8±0.2) TBq/g体内分布研究显示抗体与肺腺癌组织有效结合。尾静脉注射48 h后,瘤/血和瘤/肌肉放射性比值均达最大值,分别为(4.06±0.13)和(5.17±0.97) %ID/g。SPECT示抗体与肿瘤有效结合。抗体注射后48 h的T/NT值（3.73±0.20）明显高于12 h（1.26±0.15）、24 h（2.18±0.16）和72 h（2.85±0.18）(均P<0.01）。结论：利用肺腺癌细胞A549和Prx Ⅰ为靶抗原,从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗Prx Ⅰ肺腺癌单链抗体。在体内抗体能与肺腺癌组织特异性结合。