肛瘘患者Th1/Th2细胞因子平衡状态及其临床意义

目的探讨肛瘘患者Th1/Th2细胞因子平衡状态及其临床意义。方法应用微量样本多重蛋白定量技术(CBA)检测49例肛瘘患者外周血清Th1/Th2细胞因子,分析各细胞因子间相关性与临床特征的关系。结果肛瘘患者外周血清IL-4水平明显低于健康体检者,差异有统计学意义(P0.01),TNF-α水平与健康体检者比较,差异无统计学意义(P0.05),IL-4/THF-α明显低于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。肛瘘患者IL-10与TNF-α呈正相关(r=0.36,P0.01),其他细胞因子无明显相关性(P0.05)。肛瘘脓液细菌阳性的患者IL-4/TNF-α值低于细菌培养阴性的患者,差异有统计学意义(P0.05)。结论肛瘘患者外周血清细胞因子以Th1细胞免疫反应为主,细菌培养阳性肛瘘患者Th1细胞免疫反应更为明显。     

浙江地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的遗传学分析

目的　分析浙江地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症的基因突变特点，探讨其遗传多样性。方法　以2015年3月至2017年9月在浙江地区出生、经浙江省新生儿遗传代谢筛查中心G6PD缺乏症筛查发现的2242例患儿为对象，收集其新生儿筛查的G6PD活性值与剩余干滤纸血斑，并提取其血斑的基因组DNA。采用MassARRAY技术检测35个G6PD突变位点。采用SPSS 22.0软件统计分析基因型与G6PD活性的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。结果　2163例检出突变，总检出率为96.47%，其中男性为96.51%（1995/2067），女性为96%（168/175）。共检出21种突变位点，44种变异基因型，其中男性半合子19型，女性杂合子14型，女性纯合子3型，女性复合杂合8型。95.93%的G6PD突变位于12、9、2、5外显子，其中c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1024C＞T、c.95A＞G、c.871G＞A、c.392G＞T占92.96%。c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1024C＞T、c.95A＞G四种基因型的G6PD活性差异有统计学意义（P＜0.0001）。结论　浙江地区G6PD缺乏症存在基因突变热点，c.1024 C＞T的突变频率具有明显地域特征，MassARRAY技术检测特定G6PD突变位点可推荐为G6PD缺乏症的二级筛查方法之一。     

全自动荧光免疫分析仪在新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查中的应用

目的：分析全自动荧光免疫分析仪（GSP分析仪）检测新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的性能。方法：应用GSP分析仪检测国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价质控品和G6PD试剂盒（荧光分析法）的低、高质控品,计算准确度和精密度。采用GSP分析仪和半自动荧光免疫分析仪（1420分析仪）同步检测2622例新生儿筛查标本和41例确诊患儿的标本,分析检测结果的相关性和一致性;采用GSP分析仪和1420分析仪检测漂浮和未漂浮标本各78例,比较检测结果差异;采用1420分析仪和GSP分析仪分别检测2017年1月至2018年12月1?100?384名新生儿筛查标本及2019年1月至2020年12月855?856名新生儿筛查标本,比较两种仪器的筛查效能。对目前使用的切值（26?U/dL）的合理性进行评估,并通过百分位数法,以第99.1百分位建立GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的新切值。结果：GSP分析仪检测5个不同浓度室间质控品的检测值与靶值的相对偏倚为0.71%~4.23%,检测G6PD测定试剂盒质控品的批内精密度为4.34%~4.91%,批间精密度为0.85%~2.12%,总变异系数为5.44%~5.72%,均符合实验要求。GSP分析仪和1420分析仪检测的G6PD活性存在明显的正相关（r=0.740,P<0.01）,均能筛查出41例确诊患儿,筛查的一致性较好（Kappa=0.945）。1420分析仪检测漂浮干血斑中的G6PD活性明显低于未漂浮干血斑中的G6PD活性（P<0.05）,而GSP分析仪检测漂浮和未漂浮干血斑中的G6PD活性差异无统计学意义（P>0.05）。GSP分析仪和1420分析仪筛查G6PD缺乏症的敏感度均为100.00%,且特异度均在99.80%以上。与1420分析仪比较,GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的阳性预测值、初筛阳性率和诊断率均上升,假阳性率下降（均P<0.01）。根据人群第99.1百分位建立新切值,男性为26.1?U/dL,女性为29.1?U/dL。结论：GSP分析仪检测性能良好,筛查效率高,更有利于疾病的检出,可用于临床新生儿G6PD缺乏症的大规模筛查。     

自体DC-CIK细胞治疗晚期肺癌患者前后T淋巴细胞亚群表面分子的表达

目的 探讨自体DC-CIK细胞治疗晚期肺癌患者前后T淋巴细胞亚群表面分子表达情况.方法 抽取63例肺癌晚期患者的外周血分离获得外周血单个核细胞(PBMC),将与患者病理分类相同的肺癌细胞株经反复冻融处理获得可溶性抗原,制备肿瘤相关抗原肽负载DC-CIK细胞,并进行质量控制后回输.应用流式细胞术检测DC-CIK细胞治疗晚期肺癌患者前后T淋巴细胞表面CD3⁺HLA-DR⁺、CD3⁺CD25⁺、CD3⁺CD4⁺CD25⁺、CD3⁺CD8⁺HLA-DR⁺、CD3⁺CD8⁺CD38⁺细胞百分比及对比治疗前后表达情况.结果 成功获得成熟DC细胞,流式细胞术检测证实DC细胞成熟的标志分子CD11c、CD83、CD86及HLA-DR的表达均较高,分别为51.6%±10.3%、50.8%±9.7%、48.9%±11.4%、61.2%±6.5%;成功获得CIK细胞细胞,流式细胞术结果显示,CD3+CD56+双阳性细胞比例占21.3%±7.6%.与治疗前相比,DC-CIK细胞治疗后CD3⁺HLA-DR⁺(12.71±1.54 vs 11.44±4.13,P<0.05)、CD3⁺CD8⁺HLA-DR⁺(7.48±1.01 vs 5.20±1.01,P<0.01)、CD3⁺CD8⁺CD38⁺(8.27±1.71 vs 6.47±1.99,P<0.01)表达明显升高,CD3⁺CD4⁺CD25⁺(5.38±1.47 vs 6.12±0.67,P<0.05)表达明显降低.结论 采用自体DC-CIK免疫细胞治疗晚期肺癌可以明显提高患者免疫力.     

慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5对肺腺癌细胞系H1299的增殖和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5（QKI-5）对肺腺癌细胞凋亡的影响。方法 应用GV358（过表达）和GV248（抑制表达）载体分别构建针对QKI-5基因的慢病毒过表达载体和抑制表达载体,转染293T细胞产生慢病毒颗粒,收集并测定慢病毒滴度。将经测序鉴定的QKI-5过表达的慢病毒或抑制表达的慢病毒转染到肺腺癌细胞H1299,Real-time PCR检测QKI-5 mRNA表达,集落形成实验检测H1299细胞增殖情况,膜联蛋白V（annexin V）、碘化丙啶（PI）检测H1299细胞凋亡情况,Western blotting检测促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表达。结果 成功构建QKI-5过表达慢病毒载体和抑制表达慢病毒载体,与对照组比较,QKI-5过表达后,QKI-5 mRNA表达增加,细胞集落形成减少,肺腺癌细胞早期凋亡增加,促凋亡蛋白Caspase-8表达增加;QKI-5抑制表达后,QKI-5 mRNA表达降低,细胞集落形成增加,但肺腺癌细胞凋亡无明显变化,然而促凋亡蛋白Caspase-8表达减少。结论 慢病毒介导 QKI-5抑制增殖,可能通过Caspase-8促进肺腺癌细胞系H1299的凋亡。     

浙江省新生儿17α-羟孕酮筛查结果分析

采用时间分辨荧光免疫方法检测新生儿足底滤纸干血斑中17α-羟孕酮的浓度,回顾性分析2014年1月至2016年12月浙江省新生儿17α-羟孕酮共1 719 510例,有出生体重、孕周、性别、孕次、采血时日龄的阳性检测结果,共7254例(宁波地区除外、先天性肾上腺皮质增生症确诊病人69例除外),经非参数Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验及Spearman秩相关对17α-羟孕酮的阳性检测结果进行统计学分析,采用百分位数浓度表示。经检验,17α-羟孕酮呈偏态分布,不服从正态分布用四分位数表示。经非参数检验,不同体重、孕周、采血日龄、孕次的阳性样本17α-羟孕酮浓度值各水平组内均存在显著差异:极低出生体重儿和低出生体重儿浓度值显著高于正常出生体重和巨大儿;极早产儿和早产儿显著高于足月儿和过期产儿;0-2天和3-7天采血的浓度值显著低于7天采血的样本;单次妊娠17-α-OHP阳性浓度值高于多次妊娠。不同性别浓度值水平组间差异不显著。在平时的筛查工作中我们应重视除孕周、出生体重外的采血日龄这项检测影响因素,减少假阳性的筛查量,以降低实验室的检测成本。     

mtND4基因突变与弱精子症精子的相关分析

目的 分析弱精子症精子mtND4基因突变与弱精子症的相关性,探索弱精子症的分子病因.方法 按WHO标准收集56例弱精子症精液标本和44例精子活力正常精液标本,用3对引物PCR扩增mtND4基因,纯化测序,分析mtND4基因突变,比较2组标本mtND4基因突变及多重单核苷酸多态性(SNP)的差异. 结果发现31个同义突变位点和12个错义突变位点,其中6个核苷酸变异位点未报道过,分别为A11026G、C11215T、A11488G、C11713T、C12908T、T10908C.对照组mtND4基因T10873C和T11944C变异率分别为61.4%(27/44)和11.4%(5/44),显著高于弱精子症组的39.3%(22/56)和0%(P＜0.05);除T10873C和T11944C变异外,错义突变分析发现,对照组10例中与T10873C或T11944C组成多重SNP 8例,而弱精子症组10例标本中仅2例,2组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);上述20例错义突变标本分成多重SNP组(与T10873C或T11944C)和非多重SNP组,多重SNP组a级精子百分率和a+b级精子百分率均显著高于非多重SNP组(P＜0.05). 结论 mtND4基因错义突变可能影响精子活动力,T10873C和T11944C多态性变异对精子活动力可能是一个有益因子,两者同时存在组成多重SNP时,两者的作用可能具有相互抵消的效应.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between mtND4 point mutation in sperms and asthenospermia. Methods Fifty-six asthenospermia cases and 44 control cases were collected using the WHO criterion for defining asthenospermia, the regions of mtND4 gene were amplified by using PCR of 3 pairs primers. Consequently, the point mutation, missense mutation and multiple single nucleotide polymorphisms (SNP) were analyzed by employing sequencing technology and bioinformatics tools. Results Six mutations never before identified were found. The frequency of single point mutation T10873C and T11944C in the control group were significantly higher than those in the asthenospermia group (P＜0.05). Eight cases involved T10873C or T11944C among the 10 cases in control groups with missense mutations were found. But, there were only 2 cases with such mutation in the 10 asthenospermia cases with missense mutations (P＜0.05). The previous 20 cases of missense mutations can be described as either multiple SNP group (with T10873C or T11944C) or nonmultiple SNP group. The percentage of a range and a plus b range of multiple SNP group of sperm was significantly higher than the non-multiple SNP group(P＜0.05). Conclusions mtND4 gene mutation, especially the missense mutation may induce loss of sperm motility. The mutations of T10873C and T11944C may be useful for sperm motility or counteract the influence for the sperm motility caused by these harmful mutations.     

弱精子症精子线粒体DNAA3243G，G3316A和T3394C突变的检测

目的：检测弱精子症精子线拉体tRNA^1eu3243位点、线粒体NDI3316位点和3394位点碱基突变频率,分析三个位点突变与弱精子症的相关性。方法：按WHO标准随机收集了69例弱精子症患者精子标本和60例正常人正常活动力精子标本,以聚合酶链反应、ApaⅠ和HaeⅢ限制性内切酶长度多态性分析和测序检测mtDNAA3243G、G3 316A和T3 394C三个位点的突变,比较两组突变频率的差异。分析G3316A和T3394C突变的氨基酸变异情况并结合生物信息学工具分析错义突变氨基酸进化保守性。结果：弱精子症精子mtDNAG3316A突变率（4．35％）、T3394C突变率（2．90％）和总突变率（7．25％）与正常对照纽（分别为5．00％、1．67名和6．67％）比较,差异无显著性。氨基酸变异分析发现,G3316A（Ala-〉Thr）、T3394C（Tyr-〉His）均为错义突变,其中T3394C突变位点所编码的氨基酸在人、牛、小鼠、爪蟾4种生物中进化具有高度保守性。结论：G3316A和T3394C突变可能不是影响人类精子活动力的主要因素。     

干滤纸血片制备环境的理化因素对实验结果的影响

目的观察新生儿疾病筛查干滤纸血片(dried blood spots)制备环境中显著影响实验结果的理化因素。方法研究组1:收集正常标本60例、阳性标本120例,于对照条件及10种特定环境下制备干滤纸血片。研究组2:另收集正常标本30例、阳性标本80例,于对照条件及7种甲醛浓度环境下制备干滤纸血片。用荧光法或时间分辨荧光免疫分析法检测标本中苯丙氨酸(Phe)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、促甲状腺激素(TSH)、17α-羟孕酮(17α-OHP)水平。用SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果 10种环境下制备的干滤纸血片Phe检测结果与对照组差异无统计学意义(P0.05),甲醛敏感阈为4.62~6.95 ppm/18 h;37℃烘箱、潮湿、紫外线照射、新装修环境、乙醇、冰醋酸、甲醛等环境下制备的干滤纸血片G6PD检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为0.30~0.38 ppm/4 h及0.21~0.24 ppm/18 h;潮湿、紫外线照射、甲醛环境下制备的干滤纸血片TSH检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为0.32~0.52 ppm/4 h及0.38~0.45 ppm/18 h;潮湿、紫外线照射、甲醛环境下制备的干滤纸血片17α-OHP检测结果低于对照组(P0.05),甲醛敏感阈为4.37~4.62 ppm/4 h及0.38~0.45 ppm/18 h。冷风快速吹干与2~8℃冷库环境下制备干滤纸血片4项检测结果与对照组差异均无统计学意义(P均0.05)。结论干滤纸血片制备环境的理化因素与新生儿疾病筛查的准确性密切相关,甲醛、乙醇、冰醋酸、紫外线照射、高温、潮湿及装修污染等是干滤纸血片制备环境的必要管控因素;冷风快速吹干与2~8℃冷库过夜可作为新生儿筛查干滤纸血片制备的备选方法。     

浙江地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的遗传学分析

目的　分析浙江地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症的基因突变特点，探讨其遗传多样性。方法　以2015年3月至2017年9月在浙江地区出生、经浙江省新生儿遗传代谢筛查中心G6PD缺乏症筛查发现的2242例患儿为对象，收集其新生儿筛查的G6PD活性值与剩余干滤纸血斑，并提取其血斑的基因组DNA。采用MassARRAY技术检测35个G6PD突变位点。采用SPSS 22.0软件统计分析基因型与G6PD活性的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。结果　2163例检出突变，总检出率为96.47%，其中男性为96.51%（1995/2067），女性为96%（168/175）。共检出21种突变位点，44种变异基因型，其中男性半合子19型，女性杂合子14型，女性纯合子3型，女性复合杂合8型。95.93%的G6PD突变位于12、9、2、5外显子，其中c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1024C＞T、c.95A＞G、c.871G＞A、c.392G＞T占92.96%。c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1024C＞T、c.95A＞G四种基因型的G6PD活性差异有统计学意义（P＜0.0001）。结论　浙江地区G6PD缺乏症存在基因突变热点，c.1024 C＞T的突变频率具有明显地域特征，MassARRAY技术检测特定G6PD突变位点可推荐为G6PD缺乏症的二级筛查方法之一。