C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

未接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者多聚酶P基因YMDD变异检测

目的 了解未经拉米夫定及干扰素抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中HBV多聚酶YMDD变异情况。方法 应用错配PCR扩增方法检测病人血清HBV的YMDD位点，选择65例病史超过半年以上、肝功能异常、HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者。结果 在65例患者中，YMDD变异阳性6例(9．07％)，阴性59例，6例变异中2例为YIDD阳性，其中1例为YMDD野毒株和变异株混合存在，4例为YYDD阳性，其中1例为YMDD野毒株和变异株混合存在。结论 本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中可存在YMDD变异株，其与野生株一样是自然存在的。     

以乙型肝炎病毒为载体的基因治疗研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)作为肝靶向性基因治疗载体的可能性。方法 用外源报告基因绿色荧光蛋白(GFP)取代HBV S基因读码框构建重组HBV载体,通过脂质体转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察外源基因的表达,半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细胞核内HBV 共价闭合环状DNA构型,常规PCR和Southern杂交检测上清液重组病毒DNA。结累 携带外源基因GFP的重组HBV载体能够在肝细胞内表达外源蛋白,此重组载体为复制缺损型,单独转染后不能在肝细胞包装与复制,在缺失包装信号ε的辅助HBV质粒下可被包装成携带外源基因的成熟重组HBV颗粒并分泌到胞外。结论 HBV可被改造成肝靶向性基因治疗载体。     

C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒作用机制的研究

目的 探讨C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用机制。方法 构建C基因截短的真核表达载体pcDNA3-△C及野生型C基因真核表达载体pcDNA3-C，瞬时转染HepG2细胞，用SDSPAGE western blot检测pcDNA3-△C、pcDNA3-C的蛋白表达。pcDNA3-△C与adwR9共转染HepG2细胞，以pcDNA3与adwR9为对照，用荧光定量PCR检测培养上清液及细胞内病毒量，用Native western blot分析C基因截短蛋白干扰核心颗粒形成。结果重组载体pcDNA3-△C、pcDNA3-C均可表达，DcDNA3-△C与adwR9共转染组上清液和细胞内病毒量较对照组降低，pcDNA3-△C和pcDNA3-C共转染组Native western blot条带与pcDNA3和pcDNA3-C共转染组条带相比较明显淡。结论 C基因截短突变体可干扰核心颗粒的形成，导致HBV复制下降。     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制

我们以体外能够表达野生ＨＢＶ的质粒ｐＨＢＶ30 91为研究对象 ,用ＧＦＰ基因替代ＨＢＶ的Ｓ读码框构建携带外源基因的重组ＨＢＶ载体ｐＨＢＶ Ｓ ＧＦＰ。为了保证重组载体中外源基因能够有效表达及整个ＨＢＶ基因读码框的顺利通读 ,在改造ＨＢＶ时保留了Ｓ基因的前 9个核苷酸使ＧＦＰ与之融合 ,从而保证Ｓ基因起始密码子附近的ＤＮＡ结构尽可能与野生ＨＢＶ一致 ,保持ＨＢＶ自身基因表达调控元件的特性。结果表明 :(1)将构建的重组ＨＢＶ基金项目 :国家自然科学基金资助项目( 30 170 85 4) ;全军医药卫生科研基金资助项目( 0 1ＭＡ0 10 )…     

C基因截短型HBV载体的复制、包装与表达

目的 探索C基因截短型重组HBV载体的复制、包装和表达。方法 采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体；瞬时转染HepG2细胞，在荧光显微镜下观察外源目的基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达；提取转染细胞胞内、胞外DNA分别进行半巢式聚合酶链反应(PCR)、非变性凝胶电泳杂交技术、sourhern blot杂交定量分析及常规PCR等分析，检测重组HBV载体的复制、包装及子代病毒的生成。结果 经酶切鉴定，C基因截短型HBV载体构建成功；转染HepG2细胞，外源目的基因能够高效表达；在辅助载体的辅助下，C基因截短型HBV载体能够在肝细胞进行复制，包装，通过定量分析，C基因截短型HBV载体的包装效率比C基因非截短型HBV，载体提高4～8倍；另外，C基因截短型HBV载体可以在辅助载体的辅助下包装成携带外源目的基因的子代病毒颗粒分泌到胞外。结论 C基因部分截短不影响HBV载体外源基因的表达和病毒的复制，而且可以提高载体的包装效率。     

IL-2和IL-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究

目的探讨瘤内注射共表达mIL-12和hIL-2质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用.方法构建pDC511hIL2-mIL12、pDC511mIL-12、pDC511hIL-2真核表达质粒载体;ELISA方法检测各组质粒在真核细胞的表达;小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内注射各组质粒DNA后,检测不同时间血清中细胞因子浓度;观察各组小鼠存活时间,肿瘤大小变化;并检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)活性.对各治疗组在质粒DNA注射后一月进行瘤体组织学观察.结果酶切鉴定各组质粒载体,均示构建成功,并能在真核细胞内高效表达相应细胞因子.瘤内注射各组质粒载体后,pDChIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL2和mIL12分别与pDC511hIL2 组(F=71.11,P<0.01)、pDC511mIL12组 (F=30.70,P<0.05)比较有显著性差异.mIL-12基因和hIL-2基因联合治疗组,肿瘤生长明显受抑制,疗效显著优于各单独治疗组和对照组(P<0.05),并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强.双基因联合治疗组,病灶内肿瘤细胞坏死明显,炎性细胞广泛浸润.结论 IL-12、IL-2基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答,两者联合运用可产生协同效应.为进一步运用高效基因导入技术进行肝癌基因治疗研究提供初步的实验依据.     

白细胞介素-12治疗小鼠肝癌的实验研究

白细胞介素(IL)-12能诱导T细胞和自然杀伤细胞(NK)细胞产生多种细胞因子，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖和功能的活化。本实验以瘤内注射表达mIL-12质粒DNA的方式，初步探讨IL-12基因治疗肝癌的作用。     

adw亚型HBV突变体与ayw亚型辅助质粒之间相互包装的研究

目的探讨adw亚型HBV突变体与ayw亚型辅助质粒之间相互包装。方法构建C基因截短adw亚型HBV表达载体pHBV-ΔC。重组载体与ayw亚型辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞。以与PGEm共转染为对照。用PCR检测细胞核内重组HBV载体cccDNA生成和培养上清中rcDNA的形成,用Native westernblot和Soutern blot检测重组HBV载体在辅助质粒pHBV3142辅助下的包装。结果在实验组细胞核内可检测到cccDNA、培养上清中可检测到rcDNA,对照组中无此结果。实验组Soutern blot见阳性信号而对照组无阳性信号。结论重组adw亚型HBV载体在辅助质粒ayw亚型pHBV3142辅助下能进行有效复制且有效完成病毒包装。