ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。     

γ干扰素对小鼠骨骼肌钝挫伤后转化生长因子-β-Smad信号通路表达的影响

目的 观察γ干扰素(IFN-γ)局部注射对小鼠骨骼肌钝挫伤后纤维化以及转化生长因子-β(TGF-β)-Smad信号通路表达的影响.方法 将30只成年雌性C57bl小鼠随机分为正常组(A组)、磷酸盐缓冲液(PBS)注射组(B组)和hIFN-γ注射组(C组),每组10只.B、C组采用50g钢球于30cm高度下砸的方法 造成双侧腓肠肌钝挫伤,分别于伤后1、2、3周局部皮下注射0.1ml PBS或hIFN-γ,A组不行任何处理;4周后取双侧腓肠肌检测.以Masson染色后计算胶原纤维面积评估骨骼肌纤维化程度,Western blot检测TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达水平.结果 Masson染色显示B组胶原面积最大为(14074.0±15.2)μm2(P<0.05),C组为(4019.0±13.4)μm2高于A组(1741.0±10.1)μm2(P<0.05);TGF-β1在B、C组表达增高(P<0.05),但两组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);3组间Smad4、7的表达差异无统计学意义(P>0.05);Smad2、3及其磷酸化蛋白在B、C组表达升高(P<0.05),其中磷酸化的Smad2、3 在C组较B组表达明显降低(P<0.05).结论 局部注射hIFN-γ,未发现影响TGF-β1的表达,但能够有效降低Smad2、3磷酸化蛋白的表达,可能是其抑制损伤骨骼肌纤维化的作用机制.

Abstract：

Objective To observe the influence of local injection of human interferon γ (hIFN-γ) on the fibrosis and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-Smad signal pathway in the skeletal muscle following acute contusion. Methods Thirty female C57bl mice were randomly divided into 3 groups as A, B and C. The mice in groups B and C were injured by heavy hit of a 50 g ball from 30 cm height to establish gastrocnemius contusion models, and then subcutaneously injected with 0.1 ml PBS and hIFN-γ respectively. No interference was given to group A. All mice were sacrificed 4 weeks later to harvest the gastrocnemius. Fibrosis was estimated by calculating collagen areas on masson staining section. Expression of the proteins as TGF-β1, Smad2, Smad3, Smad4 and Smad7 was detected by Western blotting. Results The collagen area on masson staining section of group B was the greatest as (14 074.0±15.2) μm2, and that in group C was (4019.0±13.4) μm2, greater than that in group A (1741.0±10.1) μm2 (P<0.05). The level of TGF-β1 was increased in both groups B and C, but without statistically significant difference between them (P>0.05). No significant difference was found in Smad4 and Smad7 protein expression among three groups (P>0.05). Total Smad2 and Smad3 were increased in groups B and C but without significant difference (P>0.05). Phosphorylated Smad2/3 level was also increased in both groups B and C, and that was lower in group C (P<0.05). Conclusion Without influence on the expression of TGF-β1, local injection of hIFN-γ could reduce the phosphorylation of Smad2/3 significantly, which probably contributed to the suppression of fibrosis within injured skeletal muscle.     

全关节镜与关节镜辅助下小切口肩袖修补术临床疗效的比较

目的探讨全关节镜下肩袖修补术与关节镜辅助下小切口肩袖修补术临床疗效的比较。方法回顾性研究了复旦大学附属华山医院在2004年3月至2006年12月间,对56肩(55例患者)肩袖撕裂患者进行两种修补方法的疗效比较,至少随访19个月,平均随访27个月。分为A组30肩(29例患者),B组26肩(26例患者);A组患者采用关节镜辅助下小切口肩袖修补术;B组患者采用全关节镜下肩袖修补术。患者随访资料包括,住院时间、并发症、关节活动度、肌力、MRI评价术后肩袖愈合情况等,并进行UCLA、VAS及ASES评分,两组进行比较。结果两组患者手术后ASES、UCLA、VAS评分测试结果均较术前有明显改善,差异具有统计学意义(P0.01);但两组组间术后评分改善情况的比较无统计学意义(P0.05)。MRI发现A组再撕裂4例(13.3%),B组再撕裂3例(11.5%),两组间的差别无统计学意义(P0.05);再撕裂患者与肩袖完整患者相比,术后ASES、UCLA、VAS评分的改善情况无统计学意义(P0.05)。结论全关节镜下肩袖修补与小切口肩袖修补治疗肩袖撕裂的临床疗效在2～3年的随访期内并无统计学差异,再撕裂的发生率为10%～15%,肩袖再撕裂与肩袖完整患者在功能方面无统计学差异。     

Smad4基因siRNA干扰对小鼠骨骼肌急性钝挫伤愈合的影响

目的:了解以慢病毒为载体的Smad4 siRNA转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌的转染效率以及抑制骨骼肌纤维化、减轻疤痕生成、促进骨骼肌损伤修复的能力。方法:用自制打击装置将54只雌性C57bl小鼠(体重20～25g)右侧腓肠肌中段造成急性钝挫伤模型,随机分为①PBS对照组、②Smad4siRNA注射组、③scrambled siRNA注射组三组,每组18只。小鼠急性钝挫伤伤后10 d,分别在三组损伤部位注射PBS、Smad4 siRNA、scrambled siRNA各0.1 ml。分别于伤后第28 d处死各组小鼠取材,荧光显微镜下观察局部绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)表达,在损伤部位取材骨骼肌组织行Real Time-PCR和Western blot方法检测Smad4基因和蛋白表达,Masson染色以及Vi-mentin免疫组化检测各组小鼠急性钝挫伤后腓肠肌局部纤维化及疤痕生成情况,生理学方法检测各组小鼠骨骼肌强直收缩和快速颤搐收缩能力,了解小鼠损伤骨骼肌愈合情况。结果:①scrambledsiRNA注射组和Smad4 siRNA注射组小鼠损伤骨骼肌部位均可检测到GFP表达,Smad4 siRNA注射组肝脏组织内并未检测到GFP表达;②Smad4 siRNA注射组损伤部位骨骼肌Smad4基因和蛋白表达明显降低;③Smad4 siRNA注射组骨骼肌疤痕生成以及vimentin表达明显低于scrambled siRNA注射组和PBS对照组;④Smad4 siRNA注射组小鼠腓肠肌强直收缩和快速颤搐收缩明显高于PBS对照组和scrambled siRNA注射组。结论:以慢病毒为载体的Smad4 siRNA可成功转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌,并长期发挥抑制Smad4基因及蛋白表达的作用,并抑制骨骼肌损伤后纤维化,减轻疤痕生成,改善骨骼肌损伤后的愈合质量,促进骨骼肌损伤修复。