血清铁蛋白化学发光免疫分析方法的建立及临床应用

利用链霉亲和素-生物素放大系统及双抗夹心法,建立检测血清铁蛋白的化学发光免疫分析方法。将生物素、辣根过氧化物酶分别标记铁蛋白的一对抗体,以链霉亲和素包被96孔发光板,铁蛋白标准品与国际标准品进行溯源,并对本法的各项性能指标进行评价。收集300份临床血清样本,使用本法与进口试剂盒同时检测,检测结果显示:相关系数r为0.97,本法的线性测量范围为10～800 ng/mL,灵敏度为0.2 ng/mL,批内、批间的变异系数(CV%)分别为3.4%～5.5%及5.0%～7.3%,与癌胚抗原、人白蛋白、人类心脏铁蛋白以及血红蛋白交叉反应率均小于1%。本法37℃、9 d热稳定性良好。表明所建立的方法各项指标均满足临床检测要求,抗体及样本用量少,操作简便,反应迅速,便于临床应用,可替代国外同类试剂盒。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达,并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养,同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化,突变基因产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。     

大肠杆菌中dAb一级结构与可溶性表达关联

抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用"试错法"优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的关联,以指导表达系统的选择或蛋白质分子的定向改造。在单域抗体dAb分子的C端末尾添加一个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。通过层次聚类、Cluster Omega对dAb氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。通过对65个CDR随机突变的dAb分子进行线性建模分析其可溶性表达量,发现对dAb胞外质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为S(丝氨酸),R(精氨酸),N(天冬酰胺),D(天冬氨酸),Q(谷氨酰胺),Y(酪氨酸),F(苯丙氨酸),G(甘氨酸),对dAb胞内质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C(半胱氨酸),N,S,Y,K(赖氨酸),A(丙氨酸),对dAb蛋白质总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T(苏氨酸)。其中R、S和G的含量显著影响dAb的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。     

不同表达模式组合对谷氨酸棒状杆菌中脑钠肽蛋白表达的影响

外源蛋白表达系统按照启动子作用方式可分为诱导型和组成型,按照蛋白表达后的定位可分为胞内表达和分泌表达。为了研究外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中最适的表达模式组合,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为模式蛋白构建用于研究谷氨酸棒状杆菌不同表达模式的快速表达体系,并利用这一体系研究脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)的最适表达模式。结果表明,相比于诱导型胞内表达、诱导型分泌表达、组成型分泌表达模式,BNP通过组成型胞内表达可达到最高的表达量。表达产物经过NI-NTA亲和层析,可得到纯化的BNP产量为235.5 mg/L,纯度可达90%。该研究构建了一套谷氨酸棒状杆菌中外源蛋白不同表达模式组合的快速检测方法,并成功实现了BNP的表达,这对以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达外源蛋白具有重要的指导意义。     

谷氨酸棒杆菌中基因NCgl2632的敲除和过表达对三种外源蛋白表达的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为应用日益广泛的蛋白表达宿主菌,其全基因组虽然已经被测序,但是一些影响蛋白表达的关键基因仍未被研究。基因NCgl2632被预测可能是影响谷氨酸棒杆菌能量代谢的关键基因之一。因此该文首先分别构建了NCgl2632敲除菌株、NCgl2632过表达菌株,测定了生长曲线和胞内ATP水平的变化,并用增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)和重链抗体可变区蛋白(variable domain of heavy chain antibody, VHH)验证该基因表达水平的变化对外源蛋白表达的影响,发现敲除该基因对外源蛋白表达量提高有利。同时,由于前期工作中发现NCgl0909的敲除表型比较有利于外源蛋白表达水平的提高,因此在其基础上构建了C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909双敲除菌株,并表达VHH蛋白进行了验证。此外,该文还选取了一种有潜力的蛋白human MutT homolog 1(hMTH1)进行了表达验证和活性检测,由于其分子质量较小且较稳定易于...     

中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

有机磷污染是食品安全的重大隐患,乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,ACh E)可用于有机磷农药残留的检测。中华蜜蜂是我国独有的蜜蜂当家品种,蜜蜂对农药的敏感性很高,中华蜜蜂来源的乙酰胆碱酯酶基因尚未被克隆并应用于食品安全监测。以中华蜜蜂头部组织总RNA为模板,经RACE方法获得了ACh E基因c DNA全序列,全长约1.8 kb。构建重组表达载体p PIC3.5K-ACh E,将目的基因表达盒整合入毕赤酵母GS115的基因组中获得重组菌株,0.5%甲醇诱导重组菌株表达ACh E蛋白,经SDS-PAGE、酶活性分析表明,中华蜜蜂ACh E基因首次克隆成功并首次在毕赤酵母中获得成功表达,筛选出一株酶活性较高的菌株,纯化的重组乙酰胆碱酯酶其活性为10 568 U/mg,可以用于有机磷农药残留的检测。     

生物过程工程研究在创新生物医药开发中应用的驱动力——生物反应器

近年创新生物医药在生物产业中的比重逐渐增大,也给生物产业带来了巨大的经济效益,靶点筛选及分子构建等上游技术的进步是促进生物医药进步的主要原因.随着目前细胞培养技术在生物医药生产中的广泛应用,对细胞培养技术的要求也不断提高,同时细胞培养技术的实现载体——生物反应器的技术改进和创新也越发凸显其重要性.本文介绍了生物反应器在创新生物医药产业中的应用种类、发展趋势及发展驱动力,回顾了全球范围内新型生物反应器的发展成果,包括新型反应器技术及过程分析技术在生物医药中的应用,最后,分析了中国生物反应器的发展现状与问题,指出了生物反应器的发展与进步应以提高生物培养过程的稳定性最终提高产品的质量而不是以提高产量为主要目标.本文详细阐述现代生物反应器技术及基于"质量源于设计"的质量控制理念在其中所起到的关键作用,以及生物反应器的技术发展的现状和未来走向.     

聚酮类化合物研究进展

聚酮类化合物是由植物或微生物产生的一类次级代谢产物,在自然界中来源广泛,目前已有上万种聚酮类化合物被发掘.聚酮类化合物具有复杂的化学结构以及丰富的生理活性,包括抗菌活性、抗肿瘤活性、抗氧化活性等,被广泛应用于农业,食品工业和医疗保健等领域.近几十年来,人们进行了大量的研究,对聚酮类化合物生物合成机制的了解逐渐深入.然而...     

毕赤酵母甲酸脱氢酶辅因子特异性改造及应用

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH, EC 1.2.1.2)在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。为了改造巴斯德毕赤酵母甲酸脱氢酶(FDH from Komagataella phaffii,KphFDH)的辅因子特异性并应用于体外NADPH辅因子再生系统，研究基于多序列比对和文献调研的结果，确定了D195、Y196为突变位点，构建了16个突变体，并表征了野生型和突变体的比酶活力和酶促反应动力学。得到最优的NADP⁺特异性突变体为KphFDH^D195Q/Y196R,其对NADP⁺的催化效率(k_cat/K_m)为1.967 L/(mmol·s),催化特异性比率[(k_cat/K_m^NADP+)/(k_cat/K_m^NAD+)]为36.426;以NADP⁺作为辅因子时，对甲酸的催化效率(k_cat<...