有机磷农药三唑磷半抗原合成与鉴定

以三氯硫磷、苯唑醇、6-氨基己酸为原料,采用3步反应合成三唑磷半抗原6-[O-乙基-O-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酰胺基]己酸,经质谱和1H-NMR鉴定表明,合成成功,为进一步制备三唑磷抗体奠定了基础。     

基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法检测赭曲霉毒素A

该研究建立了一种基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）检测牛奶中的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）。采用磁微球偶联二抗,吖啶酯标记OTA-BSA偶联物,优化了磁微球浓度、OTA抗体浓度、吖啶酯标记物浓度、抗体和标记物稀释液、反应时间、样品预处理条件等各种CLIA方法的试验条件。结果表明,CLIA方法对OTA的检出限为6.38 ng/kg,半抑制浓度（IC50）为31.40 ng/kg,线性范围为11.23~99.20 ng/kg,批内和批间的变异系数<8%;测定牛奶样品中的OTA时,检出限为25.52 ng/kg,IC50为125.60 ng/kg,线性范围为44.92~396.80 ng/kg,添加回收率为95.08%~105.83%;对赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C的交叉反应率为6.52%和24.57%,对其他真菌毒素均无明显的交叉反应;对牛奶样品的检测结果与高效液相色谱-串联质谱法一致;且CLIA方法的试剂能在2~8 ℃稳定保存9个月以上。该研究建立的CLIA方法,具有灵敏、准确、快速和操作便捷等特点,检测时长仅30 min,尤其适用于大规模牛奶样品中OTA残留的快速筛查。     

食品危害物重组抗体的亲和力提升策略研究进展

重组抗体作为新一代基因工程抗体,以其结构简单、易表达和修饰改造等特点被广泛应用于食品危害物的免疫快速检测。然而,重组抗体制备技术的非定向性和非精准性导致抗体的亲和力不高,严重影响并限制了重组抗体的应用,因此,当前研究亟需提升重组抗体亲和力。本文概述食品危害物重组抗体的制备技术,分别从重组抗体突变进化、突变库筛选、常规多价抗体制备、抗体融合蛋白的自组装等方面阐述重组抗体的亲和力提升策略,并探讨该领域目前的技术瓶颈和发展方向。     

邻苯二甲酸二甲酯免疫层析快速检测试纸的研制

邻苯二甲酸酯类塑化剂是一类具有生殖毒性的环境激素类物质,通过违规添加或迁移而造成食品污染问题颇为严峻,开发适合现场的塑化剂快速监测方法非常重要。本研究以邻苯二甲酸二甲酯(DMP)为对象,建立了DMP的胶体金标记免疫层析检测试纸方法。采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了胶体金,将其标记DMP多克隆抗体,制备了金标抗体;采用棋盘法和单因素试验确定最佳包被浓度和二抗浓度分别为3000μg/mL和1600μg/mL,抗体浓度为稀释1.4倍,基于此建立了DMP免疫层析快速检测方法,其检测限为0.4μg/mL,5 min内肉眼可观察到检测结果,与其它结构功能类似物无明显交叉反应,特异性良好,白酒样品添加检测结果与GC-MS法相符。本法快速简单,稳定可靠,适用于实际样品中DMP的现场快速检测。     

对硫磷酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

通过制备对硫磷的多克隆抗体,建立了对硫磷的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原和包被抗原。使用对硫磷抗血清,经优化条件参数建立了对硫磷的icELISA分析方法。该方法检测线性范围为3.39～533.05ng/mL,最低检测限为0.90ng/mL,对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为75.6%～127.4%,能用于实际样品中对硫磷的检测。     

氟喹诺酮药物格林沙星抗体制备及其icELISA方法建立

目的:制备格林沙星多克隆抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。方法:采用碳二亚胺法将格林沙星偶联于牛血清白蛋白(BSA)作为免疫原,免疫新西兰大白兔获多克隆抗体;采用活泼脂法分别将格林沙星、克林沙星、加替沙星、培氟沙星和沙拉沙星偶联于卵清白蛋白(OVA),制备5种包被抗原并做性能比较;建立icELISA方法并对其灵敏度和特异性进行评价。结果:成功制备了免疫原和包被抗原及抗体,抗体效价最高达64 000倍。以克林沙星-OVA作异源包被,建立的icELISA方法灵敏度最高,半抑制药物浓度(IC50)为9.14 ng/mL,检测限(IC10)为0.9 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.3~36.4 ng/mL,与其他喹诺酮类药物无明显交叉反应。结论:首次制备出格林沙星抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法,该法灵敏度高、特异性强,为分析生物样品中格林沙星含量的测定提供了1种新的方法。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

食品安全免疫层析检测技术研究进展

免疫层析技术(immunochromatography assay, ICA)不仅有效结合了层析法卓越的分离能力以及常规免疫分析方法的高度特异性,而且简单、快速、灵敏,为现场即时筛查提供一种理想的技术手段。近年来,免疫层析技术在食品安全检测中不断更新、完善和发展,包括标记材料、信号增强、高通量和定量分析等的技术革新,显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。本文总结归纳了ICA在食品安全检测中的最新应用进展,汇总分析了ICA在我国食品安全领域标准化的情况,并讨论了ICA现有的不足以及在未来应用中的发展方向,以期为我国食品安全快速检测的发展提供技术参考。     

抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的初步研究

初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导时间和培养基对CBLscFv-AP融合蛋白表达量的影响以及重组质粒的稳定性。选用E·coliBL21(DE3)pLysS为宿主菌,在初始pH为7·4的LB培养基中培养至A600nm为0·8～0·9时,诱导表达8h,为CBLscFv-AP融合蛋白最佳表达条件。而且重组质粒pBV220-scFv-phoA具有较好的结构稳定性。在该表达条件下,提高了CBLscFv-AP融合蛋白的表达量,为进行大规模发酵生产CBLscFv-AP融合蛋白奠定基础。     

沙丁胺醇人工抗原合成及鉴定研究

用琥珀酸酐将沙丁胺醇活化后制备出半抗原沙丁胺醇半琥珀酸,经电喷雾电离质谱(ESI-MS)、红外光谱(IR)和核磁共振(1H-NMR)鉴定合成成功,同时证实琥珀酸酐连结在沙丁胺醇乙醇胺的羟基处,且半抗原以内胺盐形式存在。用混合酸酐、活泼酯方法将沙丁胺醇琥珀半酸分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原,经紫外吸收法鉴定偶联成功,偶联比分别为12.8:1、23:1。本研究为进一步制备沙丁胺醇抗体奠定了基础。