Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph进行毕赤酵母密码子优化后,进行全基因合成,并构建了重组酵母菌P. pastoris X33-ppicZalphA-sph,对重组酶进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的最适反应温度和最适反应pH为40 ℃和8.0,且其为20~30 ℃中保温10 h仍有80%以上的酶活力、在pH7.0~9.0条件下孵育24 h,仍能保持60%以上的酶活性。K+、Sr2+对酶活有明显激活作用,而Fe3+、Ba2+对酶活有明显抑制作用;重组蛋白酶SPH在极性常数为0.8~3.1的25%的正丁醇、环己烷、二甲苯中孵育6 d后,仍能保留50%以上的酶活性。本研究为B. phaericus 2297和B. phaericus DS11蛋白酶有机溶剂耐受性机制的研究奠定基础。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

Thermococcus siculi HJ21 α - 淀粉酶Asp186定点突变对酶活性的影响

为确定超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶(TSA)中特定氨基酸及所在位点与酶活性间的关系,以含TSA基因的pEt-28a-His6质粒为模板,利用定点突变技术,将第186位点的天冬氨酸(Asp)突变为天冬酰胺(Asn),突变子转化至E. coli BL21(DE3)并经IPTG诱导表达,测定突变前后的酶活性,定点突变后的TSA无酶活性;采用DNAStar和Deepview蛋白分析软件,预测突变前后TSA蛋白的二级结构和三级结构,结果表明Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶的186位点对维持TSA的酶活性具有重要意义,它的突变导致酶蛋白二级结构组件及氢键网络的改变。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

微生物发酵法制备太平洋牡蛎水解液

将米曲霉Aspergillus oryzae AS3.951接种到太平洋牡蛎(Ostreagigas thunberg)肉匀浆液中发酵培养,利用米曲霉产生的蛋白酶和淀粉酶水解牡蛎肉制备牡蛎水解液。通过单因素试验及正交试验探索发酵条件对太平洋牡蛎蛋白质回收率和糖原回收率的影响,发现起始pH为7.0时,蛋白质浓度为15%,装液量20%(V/V),140 r/min,30℃发酵48h,蛋白质回收率和糖原回收率最大,分别为85.33%和90.52%。这表明利用米曲霉发酵太平洋牡蛎制备水解液是可行的,并为进一步利用统计学方法提高米曲霉发酵太平洋牡蛎制备高蛋白回收率和糖原回收率水解液奠定基础。     

海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化

对海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2产几丁质脱乙酰酶发酵培养基和发酵条件进行优化,提高发酵产酶水平。在单因素实验优化的基础上,利用PB试验筛选显著影响菌株发酵产酶酶因素,进一步利用响应面法优化这些因素,获得最佳发酵培养基和培养条件。利用单因素实验优化获得碳源、氮源、金属离子、发酵温度、发酵时间、装液量、初始pH和转速的最佳条件。PB试验筛选获得显著影响发酵产酶的因素为MgSO₄、发酵温度和葡萄糖。运用Box-Behnken设计,通过响应面法对上述3因素进行优化,获得Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2最佳培养基配方为:葡萄糖0.5%,酵母粉1%,MgSO₄ 0.015%;发酵条件为:发酵温度38 ℃,初始pH7.0,转速140 r/min,发酵时间84 h,接种量2%,装液量40%。在此条件下Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2产几丁质脱乙酰酶酶活为14.58 U/mL,较优化前提高了2.5倍。本研究结果为Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2几丁质脱乙酰酶的进一步开发和应用奠定试验基础。     

海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自连云港海域的海洋细菌(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)菌株产蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明,在发酵温度为20℃、培养基pH 值为8.0、NaCl 质量浓度为20g/L、接种量2.5% 和装液量20% 时产酶较高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鱼粉和酵母粉有利于蛋白酶的产生。该酶的最适作用温度为35℃,0℃时相对酶活力达21.7%。45℃条件下保温60min 后酶活力仍能保持80% 以上。酶的最适作用pH 值为10.0,pH 值为7.0～11.0 范围为时,酶活力相对比较高。酶在pH8.0～11.0 范围内稳定,最稳定的pH 值为10.0,属于低温碱性蛋白酶,Mn2+、Cu2+、Ca2+ 对其具有较强的激活作用,Hg2+ 较强地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制该蛋白酶,EDTA 无影响表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。     

雪莲薯原汁加工工艺及其对双歧杆菌生长的影响

为研究雪莲薯原汁的加工工艺及其对双歧杆菌生长的影响,在漂烫工艺中,选用100℃、2.5min 的工艺条件,通过正交试验确定纤维素酶酶解的最佳工艺条件为纤维素酶用量0.08%(m/m)、pH5、温度50℃、酶解时间45min。利用果胶酶提高雪莲薯汁的澄清度,果胶酶用量为0.14%。雪莲薯原汁可有效促进双歧杆菌的生长,10%(m/m)添加量可使双歧杆菌生长量增加53%,20%(m/m)添加量对大肠杆菌有一定抑制作用。     

沙光鱼肌肉营养成分分析及营养学评价

测定连云港特产鱼类——沙光鱼的肌肉营养成分并对其进行营养学评价。沙光鱼的肌肉(鲜样)中水分、粗脂肪、粗蛋白和粗灰分分别为76.32%、1.52%、18.06% 和1.23%。沙光鱼肌肉共检测出18 种氨基酸,其中,谷氨酸含量最高,达到2.27%,必需氨基酸占总氨基酸的比值为46.79%,必需氨基酸和非必需氨基酸的比值为87.93%。沙光鱼的必需氨基酸评分和化学评分表明其第一限制性氨基酸为色氨酸。必需氨基酸指数为75.95。单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)、二十碳五烯酸(EPA)+ 二十二碳六烯酸(DHA)在总脂肪中含量分别为37.97%、22.20% 和10.20%。以上结果表明沙光鱼营养价值较高、并具有保健作用,具有较好的开发前景。