γ-H2AX分析用于检测电离辐射致HepG2细胞DNA双链断裂的研究

目的 应用γ-H2AX分析检测电离辐射导致肝癌细胞株HepG2基因组DNA双链断裂的情况，并检测在不同细胞周期时相中的表达差异，从而了解不同时相HepG2细胞株的辐射敏感性。方法利用胸腺嘧啶核苷（TdR）阻断HepG2细胞于G1期末，于不同时间点分别得到同步化的S期和G2/M期细胞，用60Coγ射线照射细胞，建立DNA双链断裂模型，采用免疫荧光法和Westemblotting检测γ-H2AX的表达。结果TdR阻断后继续培养至34和40h，分别得到了较高同步化程度的S期和G2／M期HepG2细胞；受照后的HepG2细胞中Y-H2AX表达较照射前显著增高，处于S期的细胞γ-H2AX表达增加更为突出。结论不同周期时相的HepG2细胞受照后均检测出不同程度的DNA双链断裂，其中S期细胞尤为敏感。γ-H2AX对DNA双链断裂快速敏感的反应使γ-H2AX分析在检测早期DNA双链损伤中具有广泛的廊用前景。     

AFP启动子调控PNP载体的构建及分析

目的分别构建三种启动子调控的大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因表达载体,检测、分析三者的表达差异.方法构建三种启动子调控的PNP基因表达载体.将三个PNP基因载体转染不同细胞株,检测PNP基因在各细胞株中表达,分析三者表达的特点.结果AF 0.3和[HRE]AF调控的PNP基因在AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达,而且后者在AFP阴性肝癌细胞中也实现了靶向性表达.结论三种PNP基因表达载体的成功构建为利用PNP/MeP-dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗打下坚实的基础.     

Screening of Efficient siRNA Target Sites Directed against Gatekeeper Genes for DNA Repair

DNA double-strand breaks (DSBs) are common le-sions that occur in cells. They are caused by exogenous sources such as ionizing radiation, and by endogenous sources such as radicals generated during metabolic processes[1]. In mammalian cells, DSBs are repaired ei-ther by the homologous recombination (HR) pathways or by the non-homologous end joining (NHEJ)[2] pathways to maintain the fidelity of human genome. The basic mechanism and factor requirements of the two pathways are different. V…     

肝硬化高同型半胱氨酸血症与MTHFR基因C667T多态性的关系

目的研究肝硬化血浆同型半胱氨酸(HCY)水平及其与N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的关系.方法采用柱前衍生化-HPLC方法检测112例健康对照者、87例肝硬化患者血浆同型半胱氨酸的水平,用多聚酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性技术(PCR-RFLP)检测其MTHFR基因C667T多态性.结果健康对照组平均血浆HCY浓度为(8.34±3.59)μmol/L,肝硬化组平均血浆HCY浓度为(21.71±4.85)μmol/L.与健康对照组相比,肝硬化组血浆HCY水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01).PCR-RFLP检测结果发现MTHFR基因型有3种,即纯合子突变TT(+/+)型,杂合子突变TC(+/)型,正常CC(-/-)型.肝硬化组中+/+型、+/型和/-型频率分别为29.9%、52.9%、17.2%;健康对照组分别为19.6%、33.9%、46.4%,两组差异有统计学意义.肝硬化组MTHFR基因突变无论是纯合子还是杂合子突变基因型,其血浆HCY水平均明显高于正常基因型.结论高同型半胱氨酸血症可能是肝硬化的一个危险因素,血浆HCY水平可作为肝硬化的一个辅助诊断指标,MTHFR基因C667T多态性可能是肝硬化高同型半胱氨酸血症的易感基因之一.     

RNA干扰在肝癌中的应用

近年来，RNA干扰(RNAi)技术已成为癌症基因治疗中令人关注的研究热点，以其高效，特异、应用广泛的特点，展示了诱人的临床应用前景。     

RNA聚合酶Ⅱ启动子SMP8在活化肝星状细胞中的活性

我们已往的研究已经证实,RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)载体表达的针对TGF β1的核酶,在体外能有效逆转活化HSC的生物学活性[1].但TGF β1是广泛存在于各种细胞中,并发挥重要生物学效应的细胞因子,因此不具组织和细胞特异性的pol Ⅲ启动子核酶表达系统,在抑制HSC活化的同时会影响到正常肝细胞或其他细胞的功能,这使得基因治疗肝纤维化变得困难.     

锤头状核酶对肝癌突变基因p53的抑制作用

目的 探讨p53核酶对肝癌细胞突变型抑癌基因p53的抑制作用。方法 应用计算机设计并合成针对突变型p53(249位密码子AGG→AGT)的锤头状核酶RZ，构建其体外转录和真核表达载体，检测核酶对突变型p53(mtp53)的体外切割作用，并在Lipofect AMINE^TM2000的介导下转染肝癌细胞MHCC97，应用逆转录聚合酶联反应(RT—PCR)检测核酶对肝癌细胞突变型p53的抑制作用。结果 测序证实核酶基因被正确克隆人体外转录载体pBSKU6和真核载体pEGFPC1中。体外切割效率为42％，而野生型p53(wtp53)没有被切割。在Lipofect AMINETM2000的介导下成功转染肝癌细胞MHCC97，RT—PCR检测证实突变型p53的mRNA水平明显下降，细胞内的切割效率为69％。结论 p53核酶可成功抑制肝癌细胞中突变型p53的表达，为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择。     

肝泰对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝保护作用的研究

目的探讨肝泰对实验性脂肪肝的保护作用及其可能机制。方法SD雄性大鼠53只，随机分为4组，即模型组（n=15）、肝泰组（n=15）、易善复对照组（n=15）、正常对照组（n=8）。利用高脂饮食建立大鼠脂肪肝模型，肝泰组给予肝泰（755mg/kg）干预，易善复对照组给予易善复（550mg／kg）干预，10周后处死所有大鼠。采用光镜及电镜观察肝脏组织学改变，检测大鼠血清总胆同醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、肝组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）及免疫组化法检测肿瘤坏死因子（TNF-α）在肝组织中表达。结果病理所见：模型组出现重度水变性和脂肪变性及点、灶状坏死；肝泰组未见重度水变性和脂肪变性，可见极少数点状坏死。肝泰组肝组织TNF-α与模型组肝组织TNF-α比较，肝泰组TNF-α蛋白含量显著减少（P〈0．05）。肝泰组血浆TC和肝匀浆GSH与模型组比较，肝泰组血浆TC较模型组显著减低，肝泰组GSH比模型组显著升高，均有显著性差异（P〈0．05）。结论肝泰对实验大鼠脂肪肝有保护作用。     

小鼠内皮抑制素真核质粒的构建表达及其体外活性

目的构建小鼠内皮抑制素(endostatin)真核表达质粒,进行分泌性表达,研究其体外生物学活性,以进一步用于肿瘤的基因治疗。方法人工合成小鼠Igκ轻链信号肽序列,RT-PCR获得小鼠内皮抑制素编码序列,一起克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,对其进行酶切鉴定和序列分析。重组质粒经脂质体介导转染受体细胞BHK-21,ELISA检测细胞培养上清中内皮抑制素的含量。用此上清作用于经bFGF刺激的ECV304内皮细胞和HepG2肝癌细胞,MTT法检测细胞的增殖。结果经酶切鉴定及DNA测序分析,Igκ信号肽序列及内皮抑制素编码序列成功克隆到目的位点上,其转染细胞上清中可以检测到分泌出的内皮抑制素,含量为(65.5±10.9)ng/106细胞;并且可以抑制ECV304内皮细胞的增殖,抑制率约为29.2%,而对HepG2肝癌细胞增殖没有影响。结论成功构建了小鼠内皮抑制素真核质粒,其分泌性表达产物可以抑制内皮细胞的增殖,具有较好的生物学活性。