B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

【摘要】 目的 本研究利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性; 攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究还较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

目的 利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以10⁵EID₅₀的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性;攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究比较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

禽源H3N2流感病毒NA基因G170R突变对奥司他韦耐药性的分析北大核心CSCD

目的探讨H3N2小鼠适应株NA基因G170R突变,对奥司他韦是否具有耐药性。方法在小鼠鼻内接种病毒前后分别给小鼠灌胃奥司他韦,分为预防治疗组,治疗组,病毒感染对照组,空白对照组。观察小鼠体重变化情况及死亡情况,每三日各组取肺组织,测定肺组织病毒滴度。结果预防治疗组和治疗组的小鼠在鼻内接种病毒后体重都有所下降,但在感染后期小鼠体重都升高并且无死亡;病毒感染对照组小鼠在鼻内接种病毒后体重迅速下降,直至第8 d小鼠全部死亡。病毒感染对照组小鼠肺病毒滴度比预防治疗组和治疗组小鼠肺病毒滴度高,且到实验第8 d,病毒感染对照组小鼠全部死亡,而预防治疗组小鼠和治疗组小鼠肺病毒滴度都在检测值以下。结论 NA基因G170R突变的H3N2小鼠适应株对奥司他韦暂无耐药作用。     

H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒株的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的探讨H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒的拯救并进行鉴定,为新型流感疫苗的研发奠定基础。方法采用脂质体转染的方法,首先依照A型流感病毒A/PR/8/34 HA嵌合片段的设计对H5 2.3.4.4谱系HA和H7亚型的HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合减毒株,对拯救成功的病毒株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定病毒滴度;从中选择H5亚型嵌合减毒株以10~4EID_(50)/50μl的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察、记录小鼠的体重变化及死亡情况,并测定攻毒后第3 d及第6 d小鼠肺脏病毒复制能力。结果成功拯救出2种A/B型嵌合减毒株,分别命名为rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110,测序显示两株嵌合减毒株的序列与预期一致,并在电镜下观察到了流感病毒样粒子。rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110株在MDCK细胞上的病毒滴度均为10^(4.50)TCID_(50)/ml;在鸡胚上的病毒滴度rA/B-H5-NS110为10^(5.25)EID_(50)/ml,rA/B-H7-NS110株为10^(5.44)EID_(50)/ml。小鼠致病性实验中H5亚型嵌合病毒感染组小鼠与对照组相比体重无明显下降,攻毒后小鼠存活率100%;攻毒后第3 d可在小鼠肺脏内检测到嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的轻微复制,第6 d时未检测到病毒复制。结论成功地拯救出2株包含有H5 2.3.4.4谱系HA基因以及H7N9流感病毒HA基因的嵌合减毒株,为B型流感病毒包装机制的研究以及新型流感疫苗的研发提供了新的思路。     

犬瘟热病毒检测方法研究进展

犬瘟热病毒属副粘病毒科麻疹病毒属成员,食肉目各科动物均有感染报道,但主要感染犬、狼、貂、狐等动物,发病率、死亡率较高,给养殖业带来巨大的经济损失。因此注射疫苗、尽早诊断本病并及时采取相应的防治措施是减少损失的有效手段。本文阐述了犬瘟热病毒的检测方法,以期为该病毒的研究提供参考。     

2株欧亚与北美谱系重排H6N8亚型禽流感病毒的遗传进化及分子特征分析北大核心CSCD

目的解析监测中发现的欧亚与北美谱系重组H6N8亚型禽流感病毒的遗传进化及分子特征,为禽流感病毒跨洲际传播及基因重排研究提供支持。方法2019年秋季在图牧吉地区采集雁鸭类粪便样品,分离H6N8亚型禽流感病毒并进行全基因序列测定,分析其遗传进化及分子特征。结果共采集雁鸭类粪便及拭子样品5062份,分离到2株H6N8LPAIV(TMJ43、TMJ120)。遗传进化分析显示,分离株病毒NA与北美的阿拉斯加地区所分离的H3N8亚型AIV的NA节片聚集在同一进化分支,HA和其它6个内部基因节片均属于欧亚进化分支,且两株禽流感病毒分别有不同的重配发生。2株H6N8亚型禽流感病毒为欧亚谱系与北美谱系基因重排毒株,其中N8基因最近一次欧亚与北美基因节片重排发生在2016年。分子特征分析显示,HA蛋白的碱性裂解位点为PQIETR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的特征。在NP蛋白,发生了具有增强鸡禽流感毒力的A184K突变。在TMJ43,NS1蛋白发生了能增强哺乳动物毒力的A/P42S突变。结论在我国内蒙古地区分离的2株H6N8亚型禽流感病毒为欧亚谱系和北美谱系的重排毒株,两毒株均发生了增强家禽和哺乳动物感染能力的突变。表明北美毒株通过候鸟迁徙进入我国,与欧亚谱系毒株发生重配并在野鸟中频繁出现,可为禽流感病毒的跨洲际传播研究提供信息支持。     

A型流感病毒通用型人源化抗体的构建及初步鉴定

目的制备A型流感病毒通用型人源化抗体并进行鉴定。方法通过文献检索、蛋白质序列数据库(Swissprot)、蛋白质结构数据库(PBD)等获得抗流感抗体的序列信息,经计算机分析软件InsightⅡ分析抗体结构,采用分子模拟、分子对接等方法分析抗体的轻、重链可变区基因结构,用昆虫细胞偏嗜密码子优化氨基酸序列,合成抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因;对合成氨基酸序列中的轻、重链可变区基因作酶切鉴定,将轻链可变区基因与杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接,构建PAC-κ-L-CH3,酶切合成的重链可变区基因与PAC-κ-L-CH3连接,构建PAC-κ-L-H-CH3重组表达载体,鉴定正确后,同杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞(sf9)中,于27℃用无血清培养基培养,收集上清,应用各亚型流感病毒株灭活后进行血凝抑制试验和ELISA试验,检测制备的抗体对流感病毒的通用性;通过荧光抗体试验检测抗体在细胞中的表达。结果重组杆状病毒表达载体转染sf细胞后,传代上清中检测到抗体;血凝抑制试效价为1︰2;ELISA结果显示有3株制备的抗体对3种流感病毒呈阳性反应,1株对实验用的流感病毒株没有反应;转染后传代细胞的荧光抗体鉴定结果显示有阳性抗体表达。结论成功采用计算机筛选合成抗流感病毒抗体基因,初步获得A型流感病毒通用型抗体。     

一株鸭源禽4型副粘病毒的分离鉴定及遗传进化特征分析

目的对不明原因死亡的家鸭进行病原鉴定及分离,对其全基因序列进行遗传信息系统发育分析,初步揭示病原的致病性和传播特点,为进一步研究禽4型副粘病毒的致病与传播机制提供科学依据。方法采集病死鸭脏器,经处理后接种SPF鸡胚,分离具有血液凝集特性的病原体。通过随机聚合酶链反应,用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,登录NCBI数据库进行BLAST比对以确定分离毒株种类;通过Sanger测序技术对病毒进行全基因组测序,采用MEGA7.0软件进行序列比对,通过邻近归并法(Neighbor-Joining)构建种系发生进化树分析其基因特征。结果分离到1株血液凝集特性的病原体(SDD01),通过电镜观察、随机聚合酶链反应及测序确定为禽4型副粘病毒。PCR扩增得到其-NP-P-M-F-HN-基因全长序列以及L基因的完整CDS区。F基因氨基酸基序分析显示,蛋白切割位点为DVQPR↓F,MDT144h,ICPI为0。系统发育分析毒株位于东半球谱系中Ib进化分支,与APMV-4/Mallard/Hubei/2014等野鸟源病毒株同源性为99.4%。结论在死亡家鸭脏器中分离到禽4型副粘病毒。该病毒对鸡的致病性较低,系统发育分析其F基因与野鸟源禽4型副粘病毒同源性为99.3%~99.4%,表明家鸭感染的禽4型副粘病毒可能由野鸟引入,并可在家禽和野鸟之间循环传播。     

长春市2018-2020监测年度甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征分析

目的 分析长春市2018-2020年度甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征,了解其变异情况及遗传进化特征.方法 选取2018-2020年度甲型H1N1流感病毒分离株72株,PCR扩增NA基因并进行序列测定;利用生物信息学软件对分离株的NA基因进行进化和变异分析.结果 长春市72株分离株与疫苗株A/Califo...