miRNA-198靶向调控表皮干细胞内FGFR1表达诱导慢性创面形成的机制研究

目的:研究miR-198对慢性创面形成的影响,探讨miR-198靶向调控表皮干细胞内成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1表达的可能机制与相关性。方法:所有大鼠以表皮干细胞培养划分为三组,对照组20只,采用基础饲料,40只复制糖尿病模型大鼠组,共32只建糖尿病大鼠慢性创面模型成功,其中16只为慢性创面组,另外16只通过快速尾静脉注射miR-198抑制剂转染系统溶液,命名为转染抑制载体组,通过免疫组织化学检测表皮干细胞表达,计算慢性创面的愈合率。通过细胞生长曲线测试和细胞周期分析miR-198对表皮干细胞的影响,实时定量PCR检测各组表皮干细胞中FGFR1表达。用Western-blot法检测各组细胞中FGFR1及下游Ras和MAPK蛋白的表达。结果:与对照组比较,慢性创面组miR-198表达量明显增高(P0.01),转染抑制载体miR-198后,表皮干细胞中表达显著性下调(P0.01),细胞周期分析发现慢性创面组会抑制表皮干细胞增殖,转染抑制载体(Anti-miR-198)阻断miR-198后表皮干细胞增殖得到恢复。免疫组化检测显示,慢性创面培养组FGFR1阳性表达数量增加,随着转染抑制miR-198载体的影响,FGFR1在转染抑制载体组表达增加更明显(P0.01)。Westernblot检测显示,在慢性创面模型中,转染抑制载体(Anti-miR-198)后,FGFR1的蛋白表达明显增加,转染抑制载体组Ras和MAPK的蛋白表达明显降低。结论:miR-198可能负向调控表皮干细胞FGFR1,抑制miR-198可以增强表皮干细胞FGFR1表达,加快表皮干细胞增殖和分化,从而能促进慢性创面愈合。     

野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时对肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达的影响

目的:观察野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达的变化,探讨Jagged2/Notch3信号在肺动脉高压发生中的作用和意义。方法:45只SD大鼠随机分为正常对照组(C组)、溶剂对照组(S组)和野百合碱模型组(M组),每组15只,通过一次性腹腔注射野百合碱50 mg/kg建立肺动脉高压模型,溶剂对照组注射相同剂量的溶媒。4周时通过HE染色观察肺血管重构,通过右心导管测定平均肺动脉压(m PAP)和右心室收缩压(RVSP)。采用免疫组化和实时荧光定量PCR等方法检测肺血管壁Jagged2/Notch3/Hes5蛋白和mRNA表达的变化。结果:与正常对照和溶剂对照组相比,4周时野百合碱模型组的血管壁显著增厚,中膜厚度百分比增加(P0.01);此外野百合碱模型组的m PAP和RVSP显著高于正常对照和溶剂对照组(P0.01);免疫组化和实时荧光定量PCR结果提示Jagged2主要表达于肺小动脉内膜,Notch3、Hes5主要表达于肺小动脉中层平滑肌,与溶剂对照组以及正常对照组相比,野百合碱模型组肺小动脉的Jagged2、Notch3和Hes5表达显著增高。结论:Jagged2/Notch3信号分子的激活可能在野百合碱诱导肺动脉高压发生中起重要作用。     

过表达Jagged1促老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移

目的 探讨过表达Jagged1对老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力的影响.方法 PBS冲洗1～2月龄和19～ 26月龄SD大鼠股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用含10％ FBS的DMEM/F12培养基差速贴壁法进行体外培养,以Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染和vWF免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为四组:对照组(未进行基因转染的老龄大鼠内皮祖细胞组)、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源内皮祖细胞组.荧光显微镜下计数GFP表达细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测Jagged1 mRNA和蛋白表达;Transwell培养和MTT法分别检测细胞迁移和增殖能力.结果 免疫组织化学、RT-PCR和Western blot检测均显示转染后Jagged1显著增高,PIRES2-EGFP-Jagged1转染组mRNA和蛋白表达均较对照组显著增强(P＜0.01);与对照组相比,过表达Jagged1显著增强老龄大鼠来源内皮祖细胞迁移和增殖能力(P ＜0.05或P＜0.01).结论 过表达Jagged1增强老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力.     

随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定

目的 寻找一种培养及鉴定大鼠主动脉内皮细胞的简便方法.方法 采用随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞并用差速消化法加以纯化,观察细胞形态学特性,用抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验鉴定.结果 培养3d即有细胞生长,1周可融合成层.抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验阳性.结论 本方法简便易行,适于推广应用.     

内皮缝隙连接在介导细胞间交联和损伤血管内皮修复中的作用

目的探讨内皮缝隙连接在介导细胞间通讯及在损伤血管内皮修复中的作用。方法采用植块法培养大鼠主动脉内皮细胞,细胞免疫荧光染色法检测大鼠主动脉内皮细胞缝隙连接蛋白37、40及47的表达,荧光漂白后恢复技术检测缝隙连接介导的细胞间通讯。机械划痕建立内皮损伤模型,每24h摄像一次以定量分析内皮损伤修复速度,并观察缝隙连接特异性阻断剂18α-甘草次酸对内皮损伤后修复的影响。结果缝隙连接蛋白37、40及47在内皮细胞中均有表达。荧光物质能够通过缝隙连接在相邻细胞间进行传递,孤立细胞荧光恢复率显著低于相邻细胞(5.70%±0.63%比82.26%±1.68%,P<0.01);而18α-甘草次酸能够抑制缝隙连接介导的细胞间通讯,18α-甘草次酸干预组荧光恢复率显著低于对照组(53.58%±1.73%比82.26%±1.68%,P<0.05)。内皮划痕宽度在对照组与18α-甘草次酸干预组之间无显著性差异(396.57±25.32μm比370.12±19.40μm,P>0.05),内皮损伤24h后,18α-甘草次酸干预组划痕宽度显著大于对照组(237.38±20.40μm比126.29±21.40μm,P<0.05)。18α-甘草次酸干预组内皮损伤完全愈合时间显著多于对照组(4.2±0.2天比2.6±0.3天,P<0.05)。结论内皮细胞间存在缝隙连接介导的细胞间通讯,而18α-甘草次酸能抑制这种细胞间通讯并减慢内皮损伤修复速度及延长其愈合时间,提示内皮细胞缝隙连接在内皮损伤后修复过程中起重要作用。     

自体间充质干细胞植入促进大鼠衰竭心肌生长因子表达、改善心室重构和心功能

目的 动物实验与临床应用显示,间充质干细胞(MSCs)改善心室重构和心功能,但MSCs这种作用的机制还不清楚.方法 从大鼠自体股骨骨髓抽取并培养MSCs,用灼伤大鼠心室游离壁的方法制作慢性心力衰竭(CHF)模型,心肌损伤坏死5d后分别在坏死边缘区和远隔区植入白体MSCs.结果 10周后与假手术组相比,CHF组大鼠在瘢痕边缘区心肌细胞核分裂指数、毛细血管密度及胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表达显著增加(P＜0.01);而在远隔区,以上指标显著下降(P＜0.05或P＜0.01).与CHF组相比,自体MSCs植入(CHF+MSCs组)显著增加了远隔区IGF-1、HGF及VEGF-A的表达,进一步增加了边缘区以上因子的表达(P＜0.05或P＜0.01),同时这两区的心肌细胞核分裂指数及毛细血管密度显著增加(P＜0.05或P＜0.01).自体MSCs植入使CHF瘢痕边缘区胶原纤维百分比显著减少而心肌纤维百分比显著增加,心室重构和心功能显著改善.结论 自体MSCs植入促进大鼠衰竭心肌生长因子表达,这种作用部分地促进了心肌和血管的再生,因此改善了心室重构和心功能.     

LXRs激动剂T0901317通过PI3K/Akt增强人脐静脉内皮细胞的增殖能力

目的观察肝X受体(liver X receptors,LXRs)激动剂T0901317对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC)增殖活性的影响。方法体外分离和培养原代HUVEC,不同浓度的T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)干预HUVEC 48 h后,采用MTS法检测HUVEC增殖情况;Western blot检测磷酸化Akt(Ser473)及总Akt的表达。结果T0901317(0～5μmol/L)呈浓度依赖性的促进HUVEC的增殖(P<0.01)和上调HUVEC中p-Akt-Ser473的表达(P<0.01),PI3K抑制剂LY294002(10μmol/L)和基因转录抑制剂放线菌素-D(actinomycin D,Act-D,5μg/ml)可以阻断T0901317(5μmol/L)上调p-Akt-Ser473的作用(P<0.01),提示T0901317通过基因转录调节的方式激活PI3K/Akt信号,此外,PI3K抑制剂LY294002(10μmol/L)预处理可以逆转T0901317(5μmol/L)促HUVEC增殖作用(P<0.01)。结论 LXRs激动剂T0901317可通过激活PI3K/Akt信号通路增强HUVEC的增殖能力。     

双层共培养模型中缝隙连接在内皮细胞调节平滑肌细胞增殖能力中的作用

目的 探讨在双层共培养体系中缝隙连接在血管内皮细胞(endothelial cell,EC)调节血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖能力中的作用.方法 采用植块法分别培养大鼠主动脉内皮及平滑肌细胞,并将2种细胞分别接种至Transwell insert膜的两侧以建立内皮细胞与平滑肌细胞双层共培养模型,并用透射电镜观察2种细胞在Tran-swell insert膜两侧生长情况.用3H-TdR掺入法观察双层共培养模型中平滑肌细胞增殖情况,并观察缝隙连接阻断剂180α-甘草次酸(18α-GA)对平滑肌细胞增殖能力的影响.结果 在共培养第1天,EC/SMC组与SMC/SMC组的平滑肌细胞3H-TdR掺入率无统计学差异[(10 900 ±1 320)cpm/weli vs(10 430±1 200)cpm/well,P>0.05].第2天,EC/SMC组中平滑肌细胞3H-TdR的掺入率有低于SMC/SMC组[(17 200±1 734)cpm/well vs(20 900±1 659)cpm/well]的趋势,但两者差异未达到统计学标准.共培养第3天时,EC/SMC组平滑肌细胞3H-TdR掺入率显著低于SMC/SMC组,两者相比有显著性差异[(25 800±1 984)cpm/well vs(33 070±3 569)cpm/well,P<0.05].在用18α-GA预处理24 h后,EC/SMC共培养3 d后平滑肌细胞3H-TdR的掺入率明显高于同期未处理EC/SMC组,两者相比有显著性差异[(30 500±2 650)cpm/well vs(25 800±1 984)cpm/well,P<0.05].结论 双层共培养模型中内皮细胞通过缝隙连接可抑制血管平滑肌细胞的增殖能力.     

肝细胞生长因子基因转染后对内皮祖细胞增殖、迁移、分泌一氧化氮及血管再生的影响

目的本研究拟用肝细胞生长因子(HGF)基因修饰内皮祖细胞(EPCs),以观察其对EPCs增殖、迁移、分泌一氧化氮(NO)及生血管能力的影响.方法采用梯度离心法分离并培养大鼠骨髓EPCs,荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)摄取和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-Ⅰ)结合荧光双染法鉴定大鼠EPCs.细胞分为HGF转染组、阴性对照组及空白对照组,HGF组用脂质体介导法导入pIRES2-EGFP-HGF质粒,阴性对照组导入pIRES2-EGFP质粒,空白对照组不导入质粒,然后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的合成及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测细胞HGF mRNA的表达来鉴定转染的EPCs.用四唑盐(MTT)法、改良的Bodyen小室及硝酸盐还原法观察细胞增殖、移行及分泌NO能力;体外成管试验用于分析细胞生血管的能力.结果原代细胞培养4天后发现可成梭形贴壁细胞,7天后细胞成集落状,原代细胞培养21天左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列,细胞DiI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-Ⅰ染色阳性.转染18h后HGF转染组及阴性对照组细胞绿色荧光蛋白检测呈阳性,转染率为40%,而空白组则呈阴性.RT-PCR结果显示,HGF转染组细胞内mRNA的表达显著高于对照组,而空白对照及阴性对照组HGF mRNA表达无显著性差异.HGF转染组细胞增殖、移行能力及分泌NO量均显著高于对照组.在ECMatrix培养基上培养12h,HGF转染组体外成管评分显著高于对照组.结论HGF基因修饰能够显著提高EPCs增殖、移行、分泌NO及生血管能力,改善EPCs的生物学功能.     

骨髓源性内皮祖细胞与内皮细胞共培养促进其向成熟内皮细胞分化的研究

目的：探讨共培养的内皮细胞对内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化的影响。方法：分离1～2个月龄,SD大鼠股骨髓,个核细胞（MNCs）,MNCs,Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染鉴定内皮细胞的特性。应用贴块法培养大鼠腹主动脉的内皮细胞,vWF免疫组化染色进行鉴定。采用Transwell培养板,上、下室分别加入内皮祖细胞和内皮细胞,15%胎牛血清的NO.2 DMEM/F12培养液培养14 d,倒置相差显微镜观察培养内皮祖细胞的形态。RT-PCR检测eNOS、vWF mRNA,流式细胞术检测CD31及KDR的表达。结果：荧光双染显示培养的单个核细胞具有内皮祖细胞特性;共培养的内皮祖细胞呈短梭型、铺路石状,培养至4 w时有复杂的网状结构形成。RT-PCR检测显示,eNOS及vWF mRNA表达均较对照组显著增加（P〈0.05）。流式细胞术分析表明,共培养组的内皮祖细胞CD31及KDR的表达,也显著高于对照组（分别为P〈0.05及P〈0.01）。结论：与内皮细胞共培养可促进内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化。