靶向性沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞DNA甲基化的影响

目的 观察DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因沉默后对人胰腺癌PaTu8988细胞的DNMT活性及hMLH-1基因CpG岛DNA甲基化状态的影响.方法 由美国Ambion公司设计合成DNMT1siRNA和阴性对照siRNA,分别用15、30 nmol/L的浓度转染胰腺癌PaTu8988细胞,以未转染组细胞作为对照.应用实时PCR和蛋白质印迹法检测DNMT1 mRNA和蛋白的表达;用DNMT活性检测试剂盒检测其活性;用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)法检测hMLH-1基因CpG岛的甲基化状态;实时PCR法检测hMLH-1 mRNA的表达.结果 转染48 h后,DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT1 mRNA表达量分别为0.573±0.026和0.143±0.044,显著低于对照组的1.020±0.217及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.900±0.475和0.938±0.327(P值均＜0.05);DNMT1 siRNA组的DNMT1蛋白表达亦低于对照组和阴性siRNA组.DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT活性分别为0.364±0.124和0.250±0.072,明显低于对照组的0.931±0.065及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.665±0.055和0.472±0.040.DNMT活性与DNMT1 mRNA表达呈正相关(r=0.69,P＜0.01).DNMT1 RNA干扰后导致hMLH-1基因CpG位点的8个甲基化减少到1个甲基化.结论 DNMT1 siRNA能特异性抑制胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1基因的表达,明显抑制DNMT的活性,并引起hMLH-1基因CpG岛去甲基化.     

CⅡTA基因调控胰腺肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达的体外研究

目的 研究CⅡTA基因对人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的影响.方法 将携带CⅢA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)分别感染人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞,培养24、48、72 h.实时PCR法检测感染细胞CⅡTA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测CⅡTA蛋白表达,流式细胞仪检测 MHCⅡ类分子阳性表达细胞百分比.结果 CaPanC-2细胞感染后24、48、72 h的CⅡTA mRNA表达量分别为对照组的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816 ±97783)倍(P<0.05);PanC-02细胞为对照组的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05).CaPanC-2和PanC-02细胞均不表达CⅡTA蛋白,感染后48 h,CaPanC-2、PanC-02细胞CⅢTA蛋白表达量为0.746±0.499和0.631±0.244.感染24、48、72 h组CaPanC-2细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%,显著高于对照组的(7.0±0.1)%(P<0.01);PanC-02细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(5.1±0.2)%、(37.3 ±2.0)%、(68.8±2.2)%,显著高于对照组的(2.2±0.2)%(P<0.01).结论 Ad-CⅡTA体外感染胰腺肿瘤细胞可促进CⅡTA基因的表达,从而促进细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达.     

原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠种植瘤模型及高频内镜超声探头对其的监测

目的 建立裸小鼠人胰腺癌原位种植瘤模型,探索监测种植瘤生长的方法.方法 将对数生长期的人胰腺癌细胞株SW1990制备成细胞悬液,原位注射于Balb/c-nu裸小鼠胰腺尾部包膜下,利用高频内镜超声(EUS)探头体表观察肿瘤结节的生长及声像图像.结果 20只裸小鼠均接种成功,1只裸鼠于接种后25 d时死亡.接种后14 d,EUS检查的瘤体大小为(8.09±2.61)mm3,肿瘤结节呈均质低回声,边界清楚,周边有包膜及声晕,形态规则,30%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号;接种后28 d,瘤体增大至(12.40±3.51)mm3,70%的肿瘤结节呈不规则形,部分为分叶状,肿块呈低回声,不均质,未见液化坏死区,70%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号.结论 原位注射法是建立裸小鼠人胰腺癌原位种植瘤模型较理想的方法,操作简便,成瘤率高;高频内镜超声显像是可靠的监测胰腺原位种植瘤的手段.     

酪蛋白空肠灌注对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺外分泌的影响

目的 观察空肠内灌注酪蛋白对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺外分泌的影响,并初步探讨其神经机制.方法 30只SD大鼠按随机数字法分为对照组、ANP组和肠内营养组.后2组以胰管内逆行注射牛磺胆酸钠法制作ANP模型.造模后24 h空肠插管分别灌注酪蛋白溶液(肠内营养组)和牛理盐水(埘照组和ANP组).每15 min收集胰液1次,共6次,记录胰液分泌量和检测胰液蛋白含量.取大鼠延髓孤束核,采用免疫组化法检测c-Fos蛋白表达.结果 ANP组和肠内营养组组内各时间段之间胰液分泌最无显著差别,两组相应时间段之间胰液分泌最也无显著差别,但均显著低于对照组对应时间段的胰液分泌量(P<0.05).对照组、ANP组和肠内营养组空肠灌注过程中胰液蛋白含量水平稳定,不同时间段间无明显差异,但ANP组和肠内营养组空肠灌注后0～15 min、15～30 min、30～45 min、75～90 min时间段内胰液蛋白含量均低于对照组(P<0.05).肠内营养组灌注后延髓孤束核c-Fos蛋白表达阳性,而埘照组和ANP组延髓孤束核c-Fos表达阴性.结论 空肠内酪蛋白灌注可促进延髓孤束核c-Fos表达,但不增加胰液分泌量和胰液蛋白含量.     

超声内镜引导下钬激光对裸鼠胰腺原位种植瘤消融效果的实验研究

目的：本研究的主要目的是探索超声内镜引导下钬激光对裸鼠胰腺原位种植瘤消融治疗的有效性,为超声内镜引导下钬激光对肿瘤的消融治疗应用于临床提供实验基础。方法：选取4-6周龄的雄性balb/c裸鼠20只,将胰腺癌细胞株SW1990接种至裸鼠胰腺,构建裸鼠原位种植瘤模型,随机分配裸鼠成2组,每组10只,实验组给予超声内镜引导下钬激光的消融治疗,对照组不给予任何治疗。于治疗后第7天,第14天和第28天予超声内镜下测量实验组及对照组裸鼠肿瘤的大小,观察裸鼠活动、食欲等变化。解剖裸鼠,取出肿瘤,行HE染色显微镜下观察胰腺肿瘤组织的病理变化。结果：所有裸鼠均可耐受超声内镜引导下钬激光的消融治疗,实验组裸鼠术后无明显不适反应,精神状态、活动量及食欲较好,对照组裸鼠精神状态逐渐恶化,身材极度消瘦,消融后28天实验组裸鼠肿瘤体积缩小,对照组裸鼠肿瘤增大,两组肿瘤体积的变化差异具有统计学意义,钬激光的治疗疗效大约持续28天左右。HE染色可见消融部位呈凝固性坏死。结论：超声内镜引导下钬激光对裸鼠原位种植瘤的消融治疗是有效的,治疗疗效大约持续28天,主要引起肿瘤组织的凝固性坏死。     

人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

胰腺癌和慢性胰腺炎中弹性蛋白酶3B(ELA3B)基因甲基化状态检测

背景：DNA甲基化指DNA中的核苷酸与甲基基团共价结合，这是一种表观遗传修饰，在许多生物学过程中发挥重要作用。目的：探讨弹性蛋白酶3B（ELA3B）基因在胰腺癌中异常表达的潜在机制。方法：以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测30例胰腺癌、20例慢性胰腺炎和10例正常胰腺组织中ELA3B mRNA的表达，以甲基化特异性PCR（MSP）检测该基因启动子区甲基化水平。结果：胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织ELA3B mRNA的表达率依次为46．7％、85．0％和100％。胰腺癌组织ELA3B基因启动子区甲基化指数（MI）显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织（7．02±6．31对2．33±0．97和3．31±0．75．P〈0．05），其中ELA3B mRNA表达阴性胰腺癌组织的MI显著高于ELA3B mRNA表达阳性组织（11．83±7．82对3．82±1．18，P〈0．05）。结论：本实验首次检测了ELA3B基因在胰腺癌和慢性胰腺炎组织中的甲基化状态，首次揭示ELA3B基因启动子区高甲基化是导致该基因在胰腺癌组织中低表达的原因之一。     

罗格列酮在急性坏死性胰腺炎中对抵抗素的影响

随着社会的发展,人们生活水平的提高,肥胖和高脂血症的人群越来越多,由高三酰甘油血症引起急性胰腺炎(AP)的发病率随之增高;而三酰甘油的调节由脂肪细胞分泌的脂肪激素调节.因此,脂肪激素在AP发病中的作用越来越引起人们的重视.抵抗素(resistin)是新近发现的由脂肪细胞特异分泌的一种多肽类激素,与胰岛索抵抗有关,可引起肥胖和高三酰甘油血症[1],并且参与炎性反应,调控细胞因子的释放[2];而过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮是一类依赖配体活化的转录因子,属于核激素受体超家族成员,是抵抗素的抑制剂,具有抗炎和免疫调节作用[3-4],但罗格列酮能否减轻急性坏死性胰腺炎(ANP)及其诱导的肺脏炎性反应及其机制尚不清楚.本研究旨在观察罗格列酮在ANP及合并肺损伤大鼠中的防治作用及其作用机制.