深静脉血栓形成患者组织因子基因多态性及其血浆水平研究

深静脉血栓形成(DVT)是严重危害人类健康和生命的疾病.据报道,60%以上的DVT患者存在遗传性危险因素,是一种多基因疾病.组织因子(TF)在启动内、外源凝血途径中均起到核心作用,并且参与血栓形成的整个过程.我们研究了TF基因多态性和血浆TF抗原及活性的相关性,现报道如下.     

组织因子启动子-1208I／D基因多态性与静脉血栓栓塞的相关性研究

本研究旨在探讨组织因子启动子-1208I／D基因多态性与静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的相关性。采用聚合酶链反应及DNA测序，对96例深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）患者、14倒肺栓塞（pulmonary embolism，PE）患者和59例健康人进行组织因子（tissue factor，TV）基因启动子序列．1208位点基因多态性分析。结果表明：该位点的基因变异为18bp碱基的插入，存在D／D、led、L／I三种基因型，基因型分布在对照组分别为D／D型67．8％，I／D型25．4％，I／I型6．8％，DVT组分别为D／D62．5％，I／D29．8％，I／I8．3％，PE组分别为D／D57．1％，I／D35．7％，I／I7．1％；D等位基因频率和I等位基因频率在对照组分别为80．5％、19．5％，DVT组分别为77．1％、22．9％，PE组分别为75．0％、25．0％。基因型分布和等位基因频率在各组间的差异无统计学意义。结论：TF启动子-1208I／D基因多态性与VTE的发病没有显著相关性，该基因可能不是中国汉族人VTE的易感基因。TF基因多态性有待深入研究。     

血小板特异性抗体检测对免疫性与非免疫性血小板减少症的鉴别诊断价值

目的检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者及非免疫性血小板减少症患者(Non-ITP)的抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa、抗GPⅠb/Ⅸ血小板特异性抗体表达,并比较其对ITP的鉴别诊断价值。方法应用改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(MAIPA)检测ITP患者、Non-ITP患者抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠb/Ⅸ特异性抗体。结果 ITP组抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗体的总阳性率均高于Non-ITP组,差异有统计学意义(χ2=6.522,P<0.05)。男、女及急、慢性ITP患者间抗GPⅡb/Ⅲa及抗GPIb/Ⅸ抗体阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠb/Ⅸ特异性抗体检测对ITP的鉴别诊断具有较高的价值,同时二者对ITP诊断的敏感度、特异度无差异,具有一定的临床应用价值。     

血友病A患者内含子22和内含子1倒位的检测及其意义

目的:通过检测血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子22、内含子1倒位的发生率,改进并完善血友病患者内含子22倒位、1倒位的实验室检测方法,并探讨其与FⅧ抑制物产生的相关性。方法:选取130例经一期法检测FⅧ:C确诊的血友病A患者,采用Bethesda方法进行FⅧ抑制物检测。采用双管多重PCR扩增技术进行内含子1倒位检测,采用长距离PCR技术进行内含子22倒位检测。结果:130例血友病A患者中发生1倒位2例(1.5%),2例均为重型血友病A患者,占91例重型血友病A患者的2.2%。71例HA患者内含子22倒位阳性患者18例(23.9%),其中34例重型血友病A患者中22倒位阳性16例,占重型血友病A的47.1%。结论:FⅧ基因内含子倒位检测方法简便、易操作,适合临床开展先证者筛查,对于HA患者倒位基因携带者及家系成员调查具有重要的意义。     

特发性血小板减少性紫癜患者血小板生成素及血小板相关抗体检测

目的 检测特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血小板生成素水平、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的变化,探讨其在ITP发病机制中的作用及临床意义。方法应用夹心酶联免疫吸附试验、流式细胞术分别检测50例ITP患者和24例正常对照血小板生成素浓度、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的比值。结果ITP患者的血小板计数为30．65±18．34×10^9／L明显低于正常对照组的226．63±45．63×10^9／L（P〈0．05）;血小板生成素水平二者的差异无显著性（分别为76．65±52．50pg／ml,71．62±23．03pg/ml,P〉0．05）;在T淋巴细胞亚群变化中,ITP患者CD3^＋T淋巴细胞百分比、CD4^＋T淋巴细胞百分比及CD4^＋／CD8^＋的比值分别为60．06±12．08％、27．74±9．67％、1．11±0．34％,均明显低于正常对照组（分别为69．89±5．56％、35．87±4．07％、1．64±0．32％,P〈0．05）,CD8^＋T淋巴细胞为31．12±12．49％则显著高于正常对照组（22．55±4．12％,P〈0．05）;ITP患者血小板相关抗体PAIgG27．19±17．43％、PAIgM41．15±15．62％、PAIgA33．18±16．37％,均显著高于正常对照组（PAIgG9．28±3．85％、PAIgM16．78±9．26％、PAIgA22．12±8．86％,P〈0．05）。结论血小板生成素、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体能较好地反映ITP的发病机制,对提高ITP诊断水平及指导临床治疗有一定的意义。     

特发性血小板减少性紫癜患者血小板生成素及网织血小板的检测意义

目的探讨检测血小板生成素（TPO）浓度及网织血小板（RP）百分率在特发性血小板减少性紫癜（ITP）发病机制中的作用。方法选取我院50例ITP患者（ITP组）和30例体检正常者（对照组）的临床资料,应用夹心酶联免疫吸附试验测定2组TPO浓度;流式细胞术检测2组RP百分率。采用全自动血细胞分析仪检测外周血血小板计数;采用常规细胞染色显微镜下直接计数法检测骨髓巨核细胞数。结果ITP组和对照组的血小板计数分别为（30．65±18．34）×10^9／L和（222．60±45．32）×10^0／L,RP百分率分别为（28．11±14．08）％和（8．19±2．46）％,巨核细胞数分别为（132．58±73．95）个／4cm2和（20．10±7．64）个／4m2,2组间血小板计数、RP百分率、巨核细胞数比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）,TPO浓度分别为（76．65±32．50）ng／L和（75．36±26．32）ng／L,2组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论TPO浓度和RP百分率对提高ITP诊断水平及指导临床有一定的意义,可作为血小板减少性疾病鉴别诊断的有用指标。同时ITP患者TPO浓度的检测对于针对性应用促进血小板生成的TPO模拟物的治疗提供理论依据。     

人类白细胞抗原-DQA1区基因多态性与血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原（HLA）-DQA1区基因多态性与血友病A患者凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物发生的相关性。方法采用聚合酶链反应一序列特异性引物技术（PCR—SSP）,对130例HA患者和90名健康对照者的HLA-DQA1区基因多态性进行检测。采用Bethesda法检测HA患者FⅧ抑制物活性。结果130例HA患者中．检出6例FⅧ抑制物阳性患者（全部为重型）,占重型患者的6．8％;对所检测FⅧ抑制物阳性患者HLA—DQA1区的各等位基因,占全部HA患者的等位基因阳性率及其在重型HA患者的等位基因阳性率作比较,差异无统计学意义（P值均〉0．05）。结论尚不能证明该区各等位基因与抑制物发生具有相关性。     

分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞及血小板特异性抗体检测在特发性血小板减少性紫癜诊断中的意义

目的 检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者及非免疫性血小板减少患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞、血小板特异性抗体的变化,评价其对诊断ITP及非免疫性血小板减少疾病的作用及临床意义.方法 应用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(MAIPA)分别检测58例ITP患者、33例非免疫性血小板减少患者及31名正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数、血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体)表达的变化.结果 ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数[(6.6±4.2)/105个外周血单个核细胞(PBMNC)]明显高于非免疫性血小板减少患者[(2.2±2.0)/105个PBMNC](P＜0.05)及正常对照组[(1.3±0.5)/105个PBMNC](P＜0.05),而分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数在非免疫性血小板减少患者及正常对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).通过ELISPOT法检测分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对ITP诊断的敏感性为70.69%,特异性为90.91%,高于改良MAIPA法的敏感性(χ2=7.03,P＜0.05).根据ROC曲线,ELISPOT区分ITP患者和非免疫性血小板减少患者的鉴别效度为0.886.结论 通过检测分泌GPⅡ/bⅢa抗体B细胞及血小板特异性抗体能够较好地反映ITP的发病机制.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞具有较高敏感性及特异性,可提高ITP的实验窒诊断水平,对指导治疗有一定的临床意义.     

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3．1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS一7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论：采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FIX功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。