2016-2018年长沙市人群及活禽市场环境H5N6亚型禽流感病毒监测分析

目的开展2016-2018年长沙市人群感染和活禽市场(live poultry markets,LPMs)环境污染H5N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)监测,为防控人感染H5N6亚型AIV提供实验室数据。方法采集2016-2018年长沙市流感样病例和不明原因肺炎病例咽拭子6909份及LPMs环境样品1719份,利用实时RT-PCR进行A型、H5、H7、H9和N6亚型AIV核酸扩增,并对82份AIV核酸阳性样品进行高通量核苷酸测序,然后对测序结果进行BLAST比对和氨基酸(amino acids,aa)关键位点分析。结果从6909份病例的咽拭子样品中检出H5N6亚型AIV核酸阳性1份,从1719份LPMs环境样品中检出A型AIV核酸阳性927份(53.93%),H5N6亚型AIV核酸阳性193份(11.23%)。高通量核苷酸测序获得14株H5N6亚型AIV的基因组序列,aa关键位点分析显示病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白连接肽第338~347位出现6个碱性aa,对禽表现为高致病性的分子特征,受体结合位点(receptor binding site,RBS)第238~240位aa(对应H3型流感病毒第226~228位编码aa)为QSG或QRG,受体特征为禽源。神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白第290位耐药基因位点aa未出现R290K突变现象,对NA抑制剂(达菲/磷酸奥司他韦)敏感;病毒PB2蛋白发生E627K和D701N(I)突变,表明病毒致病力强。结论长沙市人群感染H5N6亚型AIV为偶发,LPMs环境H5N6亚型AIV污染较重,需要进一步加强LPMs环境AIV监测。     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

虎红平板凝集试验检测人血浆布氏菌抗体干扰来源分析及处理对策

目的探讨虎红平板凝集试(RBPT)检测人血浆中布氏菌抗体干扰来源及处理对策。方法选取14例布病抗体阳性人员和20例健康人员,收集血清和枸橼酸钠、K2EDTA、肝素钠抗凝血浆,分别做RBPT和试管凝集试验(SAT)分析干扰情况;20例健康人员血清中分别加入3种不同抗凝剂后做RBPT分析是否抗凝剂直接干扰;20例健康人员3种不同抗凝剂血浆加入凝血酶时间(TT)检测试剂,温育1 h后,取上清做RBPT分析干扰来源和应对措施。结果 14例布病抗体阳性血清和血浆SAT结果相同;20例健康人员血清和血浆的RBPT结果完全相反,血清中加入3种不同抗凝剂对RBPT无影响,经TT试剂去除纤维蛋白原处理后的血浆标本除肝素钠组外,其他RBPT结果均与血清组相同。结论血浆不能直接做RBPT,纤维蛋白原能与虎红抗原产生非特异性凝集,是RBPT干扰的来源;可以通过TT试剂去除纤维蛋白原后消除干扰;在无法得到血清标本时,也可以直接用血浆做SAT来提供诊断参考。     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×10^2cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。     

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法,对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物,建立PCR方法,利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价,对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测,并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株,对照菌DNA未出现目的条带;敏感度为100拷贝/反应;PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带,鉴定结果为布鲁菌,与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法,与分离培养法相比,布鲁菌PCR方法准确、快速,适合布鲁菌病疫情的快速检测。     

广东珠海市2007年登革病毒分子流行病学分析

目的了解2007年珠海市登革热暴发期间登革Ⅰ型（ZH1067/07）及Ⅱ型（ZH1340/07）病毒序列特征和可能的传播来源。方法以GenBank公布的病毒AB178 040和M29 095为参考,分别设计PCR引物,扩增病毒ZH1067/07和ZH1340/07全基因组的不同片段并测序,通过末端重叠序列进行拼接组成病毒全基因组序列。序列GenBank登录号分别为Eu359 008和Eu359 009。参考已公布的登革Ⅰ/Ⅱ型病毒全基因组序列进行进化分析。结果拼接后的登革Ⅰ型病毒基因组全长10 735个核苷酸,经序列进化分析,属登革Ⅰ型中的第1群（基因Ⅰ型）,与2004年分离自日本的登革Ⅰ型毒株AB178 040及分离自福建的登革Ⅰ型毒株Fj231/04核苷酸同源性最高,达99%（10 638/10735）,经流行病学证据支持福建输入病例导致珠海本地暴发;拼接后的登革Ⅱ型病毒基因组全长10 723个核苷酸,经序列的进化分析,属登革Ⅱ型病毒中的第4群（基因Ⅳ型）,与2005年分离自文莱的登革Ⅱ型EU179 857和EU179858两毒株距离最近,核酸同源性99%,（10 609/10 705）。流行病学调查证明2例均为澳门输入病例。结论2007年珠海登革Ⅰ型病毒ZH1 067/07可能来源于福建登革Ⅰ型毒株Fj231/04,与来源于密克罗尼西亚的AB178 040有很近的亲缘关系;珠海登革Ⅱ型病毒ZH1340/07可能由澳门输入,与文莱EU179 857有很近的亲缘关系,未导致珠海本地暴发。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

长沙市家禽市场环境中H5N1亚型禽流感病毒传播风险研究

目的 对长沙市家禽市场职业暴露人群进行禽流感病毒（AIV）H5N1亚型抗体水平和环境AIV核酸检测,并对环境中AIV H5N1亚型的血凝素（HA）基因进行测序分析。方法 抽取长沙市1个区和1个县,各选择2个城区或乡镇家禽市场进行职业暴露人群H5N1抗体和环境AIV核酸检测。利用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）对102份家禽市场职业暴露人员血清标本进行H5N1抗体检测,real-time PCR方法检测160份家禽市场环境标本（污水、禽类粪便、羽毛和禽类笼具表面涂抹标本）AIV核酸,对4份污水H5N1亚型AIV核酸阳性标本进行HA基因RT-PCR扩增和TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega 5.0软件进行氨基酸比对和进化树构建。结果AIVH5N1抗体监测结果显示,家禽市场职业暴露人群血清H5N1抗体阳性率为25.5%（26/102）,其中乡镇和城区家禽市场职业暴露人群阳性率分别为50.0%（9/18）和25.4%（17/67）,乡镇家禽市场职业暴露人群阳性率高于城区。长沙市家禽市场环境中H5亚型AIV核酸阳性率为31.3%（50/160）,其中乡镇家禽市场阳性率为37.3%（31/83）,高于城区家禽市场24.7%（19/77）;不同标本H5亚型AIV核酸阳性率不同：污水（50.0%,24/48）、羽毛（44.5%,4/9）、禽类粪便（29.8%,14/47）和禽类笼具表面涂抹（14.3%,8/56）;差异均有统计学意义（P＜0.01）。TA克隆测序得到4个AIVH5N1亚型HA基因序列,进化树显示4个AIVH5N1亚型HA基因与中国内地和香港禽来源的AIV分离株为同一分组,属于欧亚分支;4个AIV H5N1亚型HA基因受体结合位点氨基酸序列仍然为禽源（QSG）、HA1和HA2蛋白之间连接肽为多个碱性氨基酸序列（RERRRKK或RERRGKK）,与入源AIV H5N1亚型具有相同的受体结合位点和高致病性的分子特征。结论 长沙市家禽市场环境中存在较多数量的AIVH5N1亚型,是导致职业暴露人群抗体阳性率达25.5%的原因之一;环境中存在的AIVH5N1亚型HA基因表现出来的高致病性分子特征,增加了家禽市场环境中发生AIV传播的风险。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。