氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:重组表达醛脱氢酶8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family member A1,ALDH8A1)蛋白,制备其多克隆抗体,并进行抗体的特异性鉴定,以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法:以成人肝cDNA文库为模板,PCR扩增ALDH8A1目的片段,并构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1,经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后,转化大肠杆菌BL21,诱导表达GST-ALDH8A1和His-AL-DH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后,纯化重组融合蛋白,并以GST-ALDH8A1免疫家兔制备抗人AL-DH8A1多克隆抗体。用His-ALDH8A1包板,ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价;Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性;免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1;获得包涵体形式表达的GST-ALDH8A1和可溶性形式表达的His-ALDH8A1融合蛋白;应用纯化的重组蛋白GST-AL-DH8A1免疫家兔,获得兔抗人ALDH8A1血清,ELISA测定抗血清的效价为1∶256000。Western blot结果显示,制备的AL-DH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、A549、HeLa、U937、HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量(Mr)约53000的ALDH8A1天然蛋白,与文献报道的ALDH8A1的Mr一致,表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论:成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体,此抗体可应用于ELISA,Western blot和免疫组化检测,为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白单克隆杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

应用国产基因工程表达的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３区抗原免疫小鼠，然后取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０融合，筛选出４株稳定分泌抗ＨＣＶＮＳ３区蛋白单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为２Ｂ６，２Ｆ３，３Ｄ８，３Ｄ９，经初步研究表明这４株单抗与ＮＳ３抗原具有良好的反应性，与ＨＣＶ核心区多肽及乙型肝炎病毒表面抗原和ｅ抗原均无反应。抑制实验表明这４株抗体分别针对ＮＳ３抗原分子上的２个不同的抗原决定簇。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究

基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内,在体内表达基因产物,进而激发宿主产生特异性免疫反应。自１９９０年首次报道发现基因免疫以来,这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用。对许多疾病（如流感）...     

脐血单核细胞体外高效扩增NK细胞方法的研究

目的建立1种使用脐血单核细胞(UCBMC)制备较高纯度自然杀伤(NK)细胞的体外高效扩增方法,并初步鉴定扩增后的NK细胞杀伤肿瘤细胞(K562)的能力。方法 6人份脐血标本来自北京妇产医院,取20 mL/份、采用密度梯度离心法分离脐血中的UCBMC,提取后的UCBMC以1×10~6个/mL细胞在4 mL含有白细胞介素(IL)-2、IL-12、IL-15和IL-21的X-VIVO15中培养5 d,期间于d2和d3添加等体积含上述细胞因子的新鲜培养基; 800 g离心将细胞后转入含1 000 IU/ml IL-2和50 ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的X-VIVO15培养基中继续培养至14 d,800 g离心收获细胞。无血清RPMI1640重悬后通过台盼蓝染色法做细胞计数测定细胞的扩增倍数;流式细胞仪检测NK细胞重要表面标志物(CD56和CD16等)及与杀伤功能相关的重要分子[CD158a、CD158b、CD158e/k、CD69、CD314(NKG2D)、CD94、CD335(NKp46)、CD337(NKp30)、CD62L、CD226(DNAM-1)、CD57和CD336(NKp44)]的表达情况;胞内染色结合流式细胞仪测定细胞杀伤重要效应分子Perforin和Granzyme B的表达情况,并以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测扩增后的细胞对K562细胞的杀伤能力。结果 6份UCBMC培养14 d:活细胞总数从培养前的4×106个扩增至(3. 6—5. 5)×10~8个,扩增倍数91—137(116±13. 1); CD3-CD56+细胞(NK细胞)占比85. 6%—95. 5%(90. 2±3. 4)%;培养得到的NK细胞表面除表达CD56分子外,还表达CD16(91. 2±2. 6)%、CD158a(71. 4±4)%、CD158b(52. 1±2. 2)%、CD158e/k(50. 3±6. 9)%、CD69(95. 6±2. 8)%、CD314(NKG2D)(94. 2±1. 7)%、CD94(94. 1±2. 1)%、CD335(NKp46)(26. 6±4. 1)%、CD337(NKp30)(94. 6±1. 5)%、CD62L(12. 8±3. 4)%、和CD226(DNAM-1)(97. 6±1. 3)%,以及CD57(4. 2±0. 9)%和CD336(NKp44)(7. 1±1)%。胞内染色结果显示:90%扩增产物(细胞)内表达与NK细胞杀伤功能相关的Perforin(86. 9±2. 7)%和Granzyme B(94. 1±2. 9)%;体外细胞杀伤试验:扩增的细胞对K562在效靶比为5∶1和10∶1时对靶细胞(K562)具有明显的杀伤作用。结论成功建立了1种从UCBMC不经纯化直接制备高纯度NK细胞的方法——其培养的细胞中表达了NK细胞重要的功能性分子,对K562细胞具有杀伤能力。     

切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体

目的 通过切胶免疫制备人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备提供抗原解决方案.方法 将腮腺液经超滤法浓缩蛋白后,进行SDS-PAGE分析,切取分子量约为50-65kDa的高丰度蛋白条带,研磨后注射新西兰大耳白兔诱导产生免疫应答并制备兔抗人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,并应用蛋白免疫印记(Western blot)等方法进行抗体鉴定.结果 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体.结论 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备及唾液蛋白质组学研究奠定基础.     

恒温核酸扩增方法的建立及其扩增产物的鉴定

目的建立一种快速、简便的恒温核酸扩增（ＮＡＳＢＡ）方法。方法用由ＡＭＶＲＴａｓｅ、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡ聚合酶以及相应的缓冲成分组成的恒温扩增系统，对４例丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ区ＲＮＡ序列进行扩增，并通过Ｎｏｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交及限制性内切酶对扩增产物进行鉴定。结果经９０分钟或１８０分钟反应后均可扩增出预期大小的产物，放射自显影在预期位置出现阳性杂交信号。扩增产物经聚合酶链反应（ＰＣＲ）及内切酶ＳｍａⅠ消化后产生预期大小的１４４ｂｐ和３５９ｂｐ的片段，第１次ＰＣＲ产物经转录实验后与ＮＡＳＢＡ直接扩增的产物具有较好的同源性。结论ＮＡＳＢＡ法是一种快速简便的核酸扩增方法，此法扩增出的产物具有良好的特异性。     

沙参麦冬汤治疗功能性便秘80例临床观察

<正>便秘是临床常见病、多发病,治疗方法颇多,笔者以沙参麦冬汤治疗此病80例,疗效肯定,现报告如下。1资料与方法1.1临床资料:将160例患者随机分为治疗组和对照组。治疗组80例,男性35例,女性45例;年龄25～78岁,平均66岁;病程6个月至15年。对照组80例,女性48例,男性     

鼠抗人醛脱氢酶1A1单克隆抗体的制备与鉴定

醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）是醛脱氢酶家族的成员之一，以同源四聚体的形式存在，定位于细胞质，在肝脏、胰腺、生殖器和皮肤成纤维细胞中高表达。ALDH1A1具有视网膜脱氢酶、醛脱氢酶（NAD）、氧化还原酶活性，参与体内多种醛类代谢，氧化不同的脂肪族醛和芳香族醛变成相对应的羧基酸，并具有电子传递及药物解毒的功能。目前市售的抗ALDH1A1抗体均为多克隆抗体，我们在成人抗肝脏胞质蛋白单克隆抗体（mAbs）库的建立过程中，应用细胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠得到多株mAbs，其中1株经鉴定确认为鼠抗人ALDH1A1单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定，为进一步研究ALDH1A1的功能提供了特异性检测工具。[第一段]