DNA微条形码技术在降解检材种属鉴定中的应用及法医学意义

【立题依据】 标准DNA条形码技术是基于COI基因序列分析而建立的一种物种鉴定方法,但由于目的基因扩增片段长达645bp,在法医物证降解检材中的应用受到限制。因此,本研究拟建立DNA微条形码技术,以解决法医物证特殊检材种属鉴定的难题。 【设计思路】 设计分别扩增不同近缘动物COI基因的通用引物,构建相应的复合扩增体系,并从种属特异性、林敏性、稳定性、案件适应性等方面进行验证。 【实验内容】 DNA提取及处理:有机溶剂法提取实验样本的基因组DNA;制备DNA<200bp的降解检材和两种动物DNA不同比例混合的混合检材。引物设计与合成:设计4对种属特异性引物和1对无种属特异性的ND3引物,并合成COI基因的标准引物。PCR扩增:①以10种动物基因组DNA为模板,分别用自行设计的4对引物进行扩增,以检验引物种属特异性;②以10种动物不同浓度基因组DNA为模板,分别用对应种属特异性的引物进行扩增,以检验引物扩增效能;③以降解检材基因组DNA为模板,分别用自行设计引物和标准引物进行扩增,以评估引物应用价值。PCR复合扩增:在确定自行设计引物特异性、扩增灵敏度的基础上,通过调整引物量和退火温度构建含有5对引物的复合扩增体系,并用于单一样本和混合样本基因组DNA的扩增。扩增产物检测:用聚丙烯凝胶电泳结合银染的方法检测各种动物模板DNA的扩增效果,以判定引物的扩增特异性和灵敏度,及降解检材和混合检材的扩增效果;用循环测序的方法获得各扩增产物的碱基序列,并通过BLAST软件与DNA数据库比对及遗传距离分析,判定检材的种属来源。 【实验材料】 常见家禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子)和常见家畜(水牛、黄牛、山羊、绵羊、马、驴、犬)共7科18种动物及人类血液样本各5例。 【可行性】 (1)不同种属动物COI基因序列可从相应DNA数据库获得;(2)熟练掌握引物设计的操作方法和PCR技术;(3)具备本研究所需的各种仪器、设备和试剂。 【创新性】 为法医物证降解检材的种属鉴定提供一种有效的方法。     

宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型方法的建立

【立论依据】 高危型HPV在感染过程中产生的病毒源性癌蛋白E6、E7在宿主细胞中呈过度表达,是致宫颈癌的关键因素。已经证实,病毒基因组整合到宿主染色体是HPV致癌的重要因素。HPV DNA的整合不但改变整合位点及临近宿主基因的表达,而且可使HPV衣壳蛋白基因(L1和L2)片段缺失,这严重限制了目前临床上使用的基于L1基因序列的HPV检测及分型。本研究拟选择宫颈癌组织高表达的E6、E7基因序列,设计特异性探针及引物,优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,可快速对宫颈癌组织中高危型HPV进行检测和分型。 【设计思路】 设计HPV不同型别E6/E7特异性探针及引物,优化PCR条件,扩增宫颈肿瘤组织标本中高危型HPV E6/E7基因,结合测序,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,对宫颈癌组织高危型HPV进行检测和分型,并与目前临床上广泛使用的检测方法比较,验证该方法的敏感性和特异性。 【实验内容】 收集低度上皮内瘤变(LSIL)、高度上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌组织样本等不同类型的宫颈肿瘤组织标本,抽提DNA;根据高危型HPV早期基因 E6/E7基因序列,在同源性分析的基础上,设计HPV不同型别的E6/E7特异性探针及引物, PCR扩增宫颈肿瘤组织标本DNA,通过基因测序验证PCR扩增的特异性;进一步优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,检测宫颈肿瘤组织标本中HPV感染及型别,并与目前临床上使用的检测试剂盒比较,分析检测的灵敏性和特异性。 【材料】 LSIL组织样本、HSIL组织样本和宫颈癌组织样本各30例; HPV16+Siha细胞、HPV18+Hela细胞;不同型别HPV的E6/E7特异性探针及引物;高保真PCR酶及反应体系;琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳检测系统等。 【可行性】 本项目立论依据充分,标本来源丰富,前期预实验已运用此方法对高危型HPV16/18完成初步分型。 【创新性】 迄今尚无相关研究报道。本检测方法的建立为我国高危型HPV流行检测及宫颈癌疫苗的推广奠定基础。     

头低位训练对脑缺血后认知功能障碍的作用及其机制的研究

【立论依据】 脑缺血是一种临床高发病,它是一种慢性进行性疾病,以学习、记忆、认知、执行功能障碍为特征的一种认知障碍性疾病,但由于其病因不明,尚无特效防治方法,选择有效的防治方案已成为亟待解决的问题。脑缺血的可逆性有赖于脑供血的功能恢复,在有效的时间窗内恢复细胞功能,减少低灌注造成的损伤。在历史上和世界上长期坚持有规律的头低位甚至倒立,能给人体带来三大益处:一是提高智力和反应能力;二是延缓衰老,增神提志;三是预防和治疗各种长期直立和劳累带来的疾病,特别是脑血管疾病。但是,尚未见有关规律性头低位训练对脑缺血后认知功能障碍的作用及其机制的具体科学研究。所以本实验应用行为学、形态学、分子生物学、生物化学等实验手段,深入研究了脑缺血急性期后头低位训练对脑缺血后沙鼠神经元的保护作用及对沙鼠认知功能的影响 【设计思路】 本课题拟通过水迷宫检测头低位不同时间点、角度,通过行为学、形态学及分子生物学比较不同组间头低位对沙鼠全脑缺血再灌注损伤影响;并检测血管内皮功能探讨头低位改善认知功能障碍的作用及其参与机制。 【实验内容】 (1)我们应用沙鼠全脑缺血模型(因为沙鼠没有Willis环,所以被广泛用于全脑缺血模型)。运用Morris水迷宫实验,观察头低位训练对脑缺血沙鼠认知功能的作用。(2)通过免疫组织化学、蛋白质印迹、real-time PCR技术,检测头低位训练对脑缺血后海马神经元学习记忆关键因子CaMKII磷酸化水平的影响。(3)通过检测血中NO含量,探讨血管内皮的功能变化。 【材料】 bcl-2抗体,bax抗体,caspase-3抗体,neun抗体,cam抗体,NO试剂盒,ROS试剂盒,沙鼠。 【可行性】 本实验室硬件设施完善,本课题所涉及方法和技术课题组同学均已掌握并可独立完成。 【创新性】 该课题致力于研究头低位训练对脑缺血后认知功能障碍的改善作用及其神经-血管耦联机制;阐明头低位改善认知功能障碍的作用及其参与机制。为脑缺血后认知功能障碍的改善提供康复手段,为其药物防治提供潜在靶点。     

原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞线粒体动力学在NO相关的内皮细胞功能障碍中的调节作用

【立论依据】 原发性高血压外周小动脉内皮细胞中均存在线粒体动力学的异常与内皮功能障碍。研究表明线粒体功能障碍发生于内皮功能障碍之前,而内皮功能障碍发生于原发性高血压之后。 【设计思路】 首先,研究原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞中的线粒体动力学的异常改变情况。然后:改变正常外周小动脉内皮细胞线粒体动力学,观察内皮细胞变化情况。其次,将正常大鼠施加相应应激因素,使其向原发性高血压方向发展,在这个过程中定时测量大鼠外周小动脉内皮细胞损伤情况、线粒体动力学情况以及大鼠血压变化,来寻找以上三者发生异常的因果关系。最后,改善原发性高血压大鼠线粒体功能,观察大鼠血压的改善情况。 【实验内容】 首先,分别取正常大鼠与原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞进行原代培养,检测两组细胞内线粒体的形态与分布;融合相关基因OPA1L、MFN1、MFN2的表达情况;分裂相关基因FIS1、DRP1的表达情况。然后,使用转染技术降低正常大鼠外周小动脉内皮细胞相应影响线粒体动力学基因的表达,检测eNOS的表达情况;BH4的含量;ROS与ONOO^-的含量。再通过转染技术使上述表达下降了的基因再次恢复表达,同样测上述指标。其次,给正常大鼠高脂质食物、限制其行动并使其一直处于恐惧中,在其向原发性高血压发展的过程中,定时监测大鼠血压变化;大鼠外周小动脉内皮细胞中线粒体的形态与分布;融合相关基因OPA1L、MFN1、MFN2的表达情况;分裂相关基因FIS1、DRP1的表达情况;eNOS的表达情况;BH4的含量;ROS与ONOO^-的含量。最后,给予原发性高血压大鼠运动与饥饿处理,观察线粒体动力学与血压的变化。 【材料】 SD大鼠与原发性高血压大鼠。 【可行性】 所涉及指标及依据背景,均有文献支持。使用的技术均为常规实验技术。 【创新性】 首次研究线粒体动力学在原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞中的改变,首次提出线粒体动力学异常与原发性高血压之间的因果关系,与线粒体动力学在原发性高血压的发生与发展中的作用。进一步寻找原发性高血压预防与治疗上新的靶点。     

大鼠血管平滑肌Caveolin-1 与TRPC1 相互作用及其在肺动脉高压中的变化

【立论依据】 业已证明,经典瞬时感受器电位1(TRPC1)通道蛋白编码的钙池操纵性钙通道(SOCC)表达上调和功能增强与肺血管增生、重构,以及肺高压密切相关,TRPC1/SOCC 存在于胞膜窖上。Caveolin-1(Cav1)是胞膜窖的主要结构蛋白,野百合碱肺高压模型大鼠和原发性肺动脉高压患者的肺血管平滑肌细胞胞膜窖分布密度和Cav1 表达都显著增加。 【设计思路与实验内容】 在对照(CON)组和慢性低氧肺高压(CH)组大鼠,采用透射电镜、定量RT-PCR 等技术和蛋白质印迹技术,观察主动脉和肺动脉主动脉上观察胞膜窖分布密度及Cav1 表达变化;此外观察胞膜窖结构被破坏后、环匹阿尼酸(CPA)、苯肾上腺素(PHEN)、内皮素-1(ET-1)和KCl 所引起的肺动脉和主动脉张力的不同变化,以明确胞膜窖的结构完整与血管平滑肌张力变化之间的关系,进一步分析这种关系在肺循环和体循环之间的异同。 【材料】 SD 大鼠、8 通道信号采集系统、定量PCR 仪、透射电镜,以及CPA、PHEN、ET-1 和MCD 等试剂。 【可行性】 已掌握完成本实验所需的技术、本项目2013 年获得国家级大学生创新训练项目资助。血管环张力实验获得初步结果:(1)两组MCD 预处理均抑制PHEN 引起主动脉张力,但是对KCl 引起的主动脉张力无抑制作用,与CON 组比较,在CH 组MCD 预处理抑制作用无进一步增强。(2)两组MCD 预处理均抑制对PHEN 引起的肺动脉张力,但对KCl 引起的肺动脉张力也无抑制作用,与CON 组比较,在CH 组MCD 预处理抑制作用也无进一步增强。提示,电压依赖性钙通道不依赖于胞膜窖的完整性,PHEN 介导的血管收缩可能依赖于胞膜窖的完整性,但慢性低氧预处理对这一过程没有影响。 【创新性】 本课题预期结果:(1)在正常大鼠上,肺动脉与主动脉上均存在胞膜窖分布密度和Cav1 表达,并对血管张力产生影响。(2)在CH 大鼠上,肺动脉胞膜窖分布密度和Cav1表达,以及血管张力的变化,可能与主动脉存在不同。本课题试图阐明肺循环与体循环血管TRPC1/SOCC 与胞膜窖(Cav1)的关系,探索慢性低氧肺高压发病过程中,肺循环与体循环血管张力变化和TRPC1/SOCC 调控的不同特点,为寻找治疗肺高压的新靶点提供理论依据。     

Diosgenin 促进髓鞘再生作用及雌激素受体在其中的介导作用探究

【立论依据】 多发性硬化病人的病灶处存在未成髓鞘的少突胶质细胞和大量的少突胶质前体细胞(OPC),更多证据均表明OPC的分化障碍是导致慢性脱髓鞘病灶处再髓鞘化失败的重要原因。有研究对具有与甾体激素相同或近似母环结构的植物甾醇单体化合物库筛选,发现薯蓣皂苷元(Diosgenin)显著促进OPC的分化。但甾体激素是否对再髓鞘有直接作用及其作用机制有待阐明。 【设计思路】 建立脱髓鞘模型,给予Diosgenin确定其对髓鞘再生是否具有直接作用及剂量关系。进一步给予雌激素受体(ER)阻断剂明确其在介导Diosgenin在髓鞘再生中的作用。 【实验内容】 (1)制备脑片培养模型 体外培养的P10大鼠小脑脑片给予Lysolecithin(溶血卵磷脂)造成急性脱髓鞘模型,免疫组化、免疫印迹等分析比较再髓鞘化程度;(2)Diosgenin在髓鞘再生中的作用 小脑脑片的髓鞘再生阶段给予不同剂量的Diosgenin处理,免疫组化、免疫印迹等比较再髓鞘化程度。进一步给予MPP(ERα阻断剂),PHTPP(ERβ阻断剂)明确ER及其不同亚型在介导Diosgenin在髓鞘再生中的作用。 【材料】 P10大鼠 【可行性】 指导教师肖林在国家自然科学基金的支持下致力于揭示甾体激素受体受体促进OPC分化和再髓鞘化的作用及内在机制。神经生物学教研室具有开展各种分子生物学的设备和能力。本课题组成员已熟练掌握需要的实验技术,并取得理想的预实验结果。 【创新性】 (1)离体小脑脑片培养脱髓鞘模型对给药(Diosgenin)刺激的效应可以消除动物模型诸多干扰因素如机体代谢的影响,也能较好模拟病理急性脱髓鞘模式,弥补分子实验模型的局限性;(2)甾体激素是目前临床治疗慢性脱髓鞘病的主要药物,但甾体激素是否对OPC的分化和再髓鞘有直接作用尚有待阐明。研究调控再髓鞘化的分子机制将为脱髓鞘性疾病的临床治疗提供借鉴;(3)实验设计巧妙,分组严谨,在确定了不同剂量的Diosgenin对髓鞘再生作用后,又能够从受体深入探讨具体的作用机制。     

胃癌细胞中VD3对NF-κB通路的影响机制及与萜类化合物协同作用探究

【立论依据】 NF-κB信号转导途径在调节细胞增殖、分化、凋亡中起到重要作用; IκB-α是调节NF-κB信号转导途径的核心蛋白;VD₃可以通过影响IκB-α、转录因子等方式抑制NF-κB信号转导途径的激活;萜类化合物是目前医药研究中很有前景的化疗药物,NF-κB的抑制可以增强其抗肿瘤效应。 【设计思路】 选取低分化、中分化胃癌细胞与正常胃组织细胞,给予其不同VD₃作用环境(时间、浓度),从mRNA、蛋白水平上测定NF-κB途径的表达活性。通过阻断VD₃和IKKβ的相互作用,研究VD₃调控IκB-α含量的主导因素。协同施用二萜类化合物--紫杉醇与VD₃,探究两者的协同作用与最佳浓度。 【实验内容】 (1)将人胃癌中、低分化的细胞株系与正常胃组织细胞(空白对照),并分别用10^-9、10^-8、10^-7mol/L培养0、4、16、24 h后用RT-PCR检测IΚB-α的mRNA含量变化,用western blot检测IΚB-α蛋白的含量变化,以ChIP检测NF-κB转录因子与DNA结合活性。(2)降低IKKβ与VD₃的结合活性,阻断VD3对IκB-α降解的抑制,定量检测IκB-α的蛋白质和mRNA含量。(3)以不同浓度比例、作用时间方式的紫杉醇与VD₃刺激胃癌胃癌,检测其存活率与细胞周期分布。 【可行性】 预实验中已证实VD₃可以使胃癌细胞中IκB-α含量上升,且刺激时间为4h的组中最为显著。 【创新性】 (1)VD₃的部分作用机制仍不明确。我们猜想VD3可能通过抑制NF-κB通路上某些具体的信号分子而发挥作用,并期望在胃癌细胞中得以验证。(2)VD₃可以通过促进IκB-α的生成以及抑制IκB-α的降解来提高其在细胞中的含量,从而抑制细胞周期。但是哪种因素占主导作用却鲜有研究。我们设计IKKβ抑制实验来探究影响IκB-α含量的主导因素,从而为更有效地调节NF-κB信号通路提供实验依据。(3)选用萜类化合物中的紫杉醇,利用NF-κB通路为其与VD₃作用机制的交叉点,进行探究。如果确认VD₃对紫杉醇杀伤癌细胞产生增敏作用,将对胃癌的临床化疗提供一种有效的治疗方案。     

牛磺酸对青春前期大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用

【目的】 探究牛磺酸对青春前期大鼠睾丸扭转复位后缺血再灌注损伤的保护作用。 【方法】 将32 只4 周龄健康雄性SD 大鼠,随机分为假手术组、生理盐水组、单次给药组(300 mg/kg)、连续给药组(300 mg/kg),每组8只,建立左侧睾丸扭转复位动物模型(720°,2 h)。生理盐水组与给药组于复位前30 min 分别腹腔注射生理盐水与牛磺酸,连续给药组术后每天注射一次牛磺酸注射液,连注7 d。于术后6周处死所有实验动物,取两侧睾丸,剔净睾丸附着筋膜,冷生理盐水洗净血污后滤纸拭干、称重。采用化学比色法检测睾丸组织中总抗氧化能力(T-AOC)及一氧化氮合酶(NOS)活性,羟胺法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA 法检测丙二醛(MDA)含量。 【结果】 (1)与假手术组比较,生理盐水组的睾丸系数有所减少,差异无显著性(P>0.05);与生理盐水组比较,单次给药组和连续给药组的睾丸系数均有所增加,差异无显著性(P>0.05);与同侧生理盐水组比较,单次给药组和连续给药组手术侧、对侧的睾丸系数均有所增加,差异无显著性(P>0.05)。与同组对侧比较,手术侧睾丸系数有所下降,差异无显著性(P>0.05)。(2)与假手术组比较,各组睾丸组织(除连续给药组SOD 活性) SOD、T-AOC、NOS 活性均下降,MDA 含量升高,其中生理盐水组各指标差异显著(P<0.05);与同侧生理盐水组比较,单次给药组手术侧和对侧SOD、T-AOC、NOS 活性均升高,MDA含量降低,其中手术侧MDA 含量差异显著(P<0.05);与同侧生理盐水组比较,连续给药组手术侧和对侧SOD、T-AOC、NOS 活性均升高,MDA 含量降低,差异显著(P<0.05)。与同组手术侧比较,两给药组SOD、T-AOC、NOS 活性、MDA 含量均升高,其中连续给药组SOD 活性、单次给药组T-AOC 活性差异显著(P<0.05)。 【结论】 牛磺酸可以通过有效清除氧自由基、保护氧化酶活性和抑制脂质过氧化,对青春前期大鼠睾丸缺血再灌注损伤有明显的保护作用,并对其对侧睾丸组织损伤亦有一定的保护作用,且连续给药明显优于单次给药。     

Raf-1对Hippo通路的调节及其对胃癌细胞生长凋亡的影响

【立论依据】 Raf-1蛋白激酶是络氨酸激酶相关的信号传导途径中的重要信号分子, Hippo通路调节细胞的生长、增殖与凋亡,被认为与人体多种肿瘤的发生存在紧密联系;近年来有研究表明Raf-1可能通过与Hippo通路核心分子MST2结合从而调控细胞的凋亡;我们希望通过研究胃癌细胞中Raf-1与Hippo通路的联系,为肿瘤诱导分化的临床应用提供一些新思路。 【设计思路】 建立对照组;检测Raf-1分子对胃癌细胞凋亡情况的影响;检测Raf-1对Hippo通路核心分子的影响。 【实验内容】 选择不同分化程度的胃癌细胞株进行培养;采用Raf-1蛋白阻断剂阻断部分细胞的Raf-1表达,蛋白质印迹法检测阻断情况;流式细胞术检测不同浓度阻断剂处理后胃癌细胞的凋亡情况;CCK法描绘阻断后胃癌细胞与未经特殊处理胃癌细胞的生长曲线; 蛋白质印迹法检测阻断剂处理后胃癌细胞中Hippo通路核心分子MST2的表达水平变化。 【材料】 胃癌细胞株BCG823,SGC7901;Raf-1蛋白阻断剂Forskolin;MST2及Raf-1抗体;CCK试剂盒;细胞凋亡与坏死试剂盒。 【可行性】 Raf-1以及Hippo信号通路均已被证实在肿瘤细胞的凋亡中发挥重要作用;目前已有研究支持在部分肿瘤细胞中Raf-1与MST2活性间存在关联;实验器材及细胞株均由实验室及瑞金医院消化科提供。 【创新性】 目前对Raf-1相关信号通路的研究多集中于MEK/MAPK信号通路,而对其在其他信号通路中的作用机制的研究尚不完全成熟;在Raf-1对Hippo通路影响的研究中,国外多采用肝癌细胞作为研究对象,我们选择不同分化程度的胃癌细胞进行研究,以观察Raf-1对不同分化程度的肿瘤细胞的影响,希望能进一步探究Raf-1在肿瘤发生、发展中的作用。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。