猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探

为了进。步分析猪笼草瓶状体内消化液中蛋白质的性质，本研究在不同的温度和pH条件下测定消化液中蛋白酶的活性，并且比较了3种不同沉淀方法对消化液蛋白进行的浓缩，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳对消化液蛋白作了初步分离。结果表明，猪笼草消化液中蛋白酶的最适酶活温度为50℃，且稳定性最高；当pH为5时，该蛋白酶活性出现峰值，采用氯仿-正丁醇法（5：1）沉淀浓缩猪笼草消化液蛋白样品效果最佳。聚丙烯酰胺电泳结果表明，消化液至少包括三种蛋白组分，分子量分别为24.3kD、35．1kD和61．4kD，且35．1kD条带具有抗胰蛋白酶消化活性。本研究为综合开发利用猪笼草野生资源提供理论依据。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种辅助辨型方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是实验室常用的基本鉴定方法之一。但由于做胶方式以及各实验室仪器设备良莠不齐，经过一系列纷繁复杂的操作，电泳结果未必尽如人意。其中凝胶带型的判断就是一个较为困惑的问题，一般的聚丙烯酰胺胶跑出的条带总体上都有弧度，越是靠近凝胶两侧越是严重。在本实验中，我们设计了一种较为简单易行的方案，即将难以区分的条带样品做成混合样marker来辅助辨型，通过调整电压和凝胶浓度来达到区分条带的目的。我们用该方案可以将相差0～3bp大小的条带区分开来。     

对岢岚县退耕还林(草)的思考

分析岢岚县退耕还林的现状,并针对近几年岢岚县退耕还林(草)存在的问题提出了市场经营,重点突破;发动群众,群防群治;间隔放牧,舍饲圈养;坚持移民,防火护林;改进技术,完善政策等相关对策。     

Lω-空间中加强了的ωT-分离性

在Lω-空间中引进加强了的ωTi（i=1,2）-分离性等概念,系统地讨论了这些概念的特征性质,得出它们保持了LF拓扑空间中Ti-分离性的主要结论,进而说明加强了的ωTi（i=1,2）-分离性是L-好的推广.     

云南油瓜开发研究初探

油瓜是一种很具开发潜力的热带油料植物，自植物学家蔡希陶先生1933年在云南发现以来，就开始了油瓜的驯化栽培研究，2008年云南农业大学香料研究所进行包括油瓜在内的油料作物立体栽培模式研究，对油瓜驯化栽培和开发有新的认识和见解。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

TTMV间接ELISA检测方法的建立

以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。     

三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。