限制性内切酶酶切确证河豚鱼成分PCR检测结果

动植物成分的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测往往出现假阳性结果,为了有效排 除河豚鱼成分检测中出现的假阳性现象,提高检测结果的准确性,应用河豚鱼PCR检测引物进行河豚鱼成分的PCR 检测与限制性内切酶NmeA Ⅲ酶切确证实验。18 个供试样品中3 个样品无PCR扩增产物,判为阴性结果,15 个样品 初步判为疑似阳性。应用限制性内切酶NmeA Ⅲ对疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分析,电泳图谱与河豚 鱼阳性对照不同的2 个样品,判定为假阳性结果,电泳图谱与阳性对照相同的4 个未知学名的河豚鱼加工样品,确 证为阳性结果,即检出河豚鱼成分,PCR产物序列经GenBank同源性序列查询比对（BLAST）予以验证,建立了简 便的河豚鱼成分PCR检测结果确证方法。     

河豚毒素DNA适配子核心区域的识别

用DNA folding form在线软件分析河豚毒素DNA适配子A3、G10的二级结构,根据二级结构,分别合成适配子A3、G10的各4个区域的5’端地高辛标记的序列。用丙烯酸-环氧乙烷珠子固定河豚毒素,测定抗地高辛碱性磷酸酶的适宜稀释倍数,用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶系统检测各区域与河豚毒素的亲和力,识别出适配子的核心区域。结果表明,抗地高辛碱性磷酸酶的适宜工作浓度为2×104倍稀释;合成的适配子A3的4个区域中,A3-2区域与河豚毒素的亲和力最强,即适配子A3的核心区域为A3-2区域,实际上含有47个核苷酸;合成的适配子G10的4个区域中,G10-4区域与河豚毒素的亲和力最强,即适配子G10的核心区域为G10-4区域,实际上含有56个核苷酸。     

13 种河豚鱼CO I基因部分DNA序列分析及在物种鉴定中的应用

应用CO I基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增通用引物,对福建省和海南省搜集的3?属13?种河豚鱼样品与9?个未知种名的河豚鱼样品的CO?I基因靶序列片段进行PCR扩增和测序,13?个已知物种样品的DNA序列提交基因库（GenBank）,取得相应的登录号。各物种CO I基因靶序列长度均为681 bp。应用DNAMAN V6软件对样品的DNA序列进行同源性比对分析,建立样品间系统关系同源树。基于CO I基因序列,供试13 个样品被划分为4?个类群组。群间的同源率为84%,群内同源率为90%～100%。根据序列同源性分析结果,9?个未知种名的样品被归类到2?个类群组中,判定这9?个样品为东方鲀属或腹刺鲀属,其中1?个样品（HNW2）为月腹刺鲀,4?个样品（HNW3、HNW4、FJW2、FJW5）为棕斑腹刺鲀,1?个样品（HNW1）为暗鳍腹刺鲀;3?个样品（FJW1、FJW3、FJW4）为横纹东方鲀。探讨基于DNA条形码技术的CO I基因靶序列片段在河豚鱼种属鉴别中应用的可能性。     

食品中五种致病性弧菌MPCR—DHPLc检测方法的建立

采用试剂盒法提取5种致病忭弧菌(霍乱弧卤、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA.分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病忭弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法.二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml.建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值.     

PCR 方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化

根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列,应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物,经过PCR 筛选,确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT-1,用于建立河豚鱼的PCR 检测方法。对该PCR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs 终浓度、引物终浓度和模板DNA 用量进行优化,确定优化的PCR 扩增体系：10 × PCR 缓冲液2μL,MgCl2 终浓度1.5mmol/L,Taq DNA 聚合酶1.0U,dNTPs 终浓度300μmol/L,引物终浓度0.2μmol/L,DNA 模板400ng,加纯水至总体积20μL。扩增程序定为94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40 个循环,72℃延伸5min。据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法,并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较,验证了该方法的河豚鱼特异性。研究结果还表明,该方法的检出限为0.1%,含量为0.1% 的河豚鱼样品PCR 检出率至少在97.5% 以上。     

饲料中的转基因成分在家禽体内代谢残留的研究

用含20%抗草甘膦转基因豆粕的饲料喂养蛋鸡、番鸭,通过检测其内脏、肌肉、血液、粪便及肠道微生物的豆粕转基因成分,探讨饲料中转基因成分在家禽体内的代谢残留状况。以定性PCR检测含20%转基因豆粕的饲料及蛋鸡、番鸭的八种内脏样品(肠、胰腺、食道、肝、腺胃、肾、心脏、肌胃)、肌肉、血液、蛋品、粪便、肠道微生物的转基因豆粕的工具基因CaMV35S启动子与NOS终止子以及目的基因CP4-EPSPS等外源基因成分。PCR检测结果表明:除了含20%转基因豆粕的饲料外,蛋鸡、番鸭的八种内脏器官、肌肉、血液、蛋品、粪便及肠道微生物中均未检出转基因豆粕的CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS等外源基因成分。检测结果表明:长期喂养含20%转基因豆粕饲料的蛋鸡、番鸭的八种内脏器官、肌肉、血液、蛋品、粪便及肠道微生物中均未发现有转基因成分残留,说明饲料中的转基因成分,通过肠胃消化后充分降解,不会在鸡、鸭体内残留,也不会通过粪便排泄而扩散到土壤环境中。     

迟钝爱德华氏菌FimA基因的克隆及序列分析

以迟钝爱德华氏菌Et、XA、EA分离株的DNA为模板,采用PCR技术,扩增菌毛亚基(FimA)基因的DNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:Et、XA、EAFimA基因由534个核苷酸组成,编码177个氨基酸。Et、XA、EA之间FimA基因核苷酸同源性为99%,与其它分离物核苷酸同源性为76%～77%,氨基酸同源性为81%～82%。     

常见食用菌中转基因成分定性PCR检测方法的建立

将食用菌转基因研究用的质粒载体(p301-bG1)DNA,添加到19种常见食用菌样品中,作为模拟阳性样品,从中提取出DNA用于PCR分析,建立了常见食用菌中3个大小分别为165、398、599bp的外源基因(NOS、BAR、GUS)的特异性DNA片段的定性PCR检测方法,还进行了二重与三重PCR分析,并通过不同的模板DNA浓度对PCR扩增结果的影响,分析了PCR检测的灵敏度。     

双孢蘑菇SRAP、ISSR、RAPD标记遗传多样性和菌群分类研究

通过PCR试验,筛选能扩增清晰稳定的DNA条带的53对SRAP引物、10条ISSR引物和56条RAPD引物。SRAP、ISSR和RAPD 3种DNA分子标记扩增位点的平均多态率分别为70.21%、78.33%、61.94%。SRAP、ISSR和RAPD扩增结果用0与1表示,共获得1 046个位点的42 840个数据。采用组间距离法和Jaccard相似性系数,应用SPSS 11.0 for Windows软件进行聚类分析,构建40个双孢蘑菇样品的遗传关系树状图。当组间距离值取16时,40个双孢蘑菇品种可分为6个类群;当组间距离值取13时,40个双孢蘑菇品种被分为9个类群。     

金黄色葡萄球菌五种肠毒素基因PCR-DHPLC检测方法的建立

本文设计合成了5种肠毒素基因的特异性引物,对PCR的退火温度、DNA模板量进行优化,建立了5种肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶链式反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)检测方法,并测定方法的灵敏度和特异性。结果表明建立的PCR-DHPLC检测方法的特异性很好,灵敏度可达到100cfu/m L。PCR-DHPLC方法具有快速、准确、高通量等优点,在进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测上有很好的应用价值。