流式细胞术快速检测假丝酵母菌药物敏感性方法的建立及应用北大核心CSCD

目的：建立基于流式细胞分析技术快速检测假丝酵母菌临床菌株药物敏感性或耐药性的方法。方法以碘化丙锭（ PI）为荧光染料,采用白假丝酵母菌ATCC90029株确定流式药敏试验门设置及最佳实验条件。采用所建立的真菌流式药敏试验检测110株假丝酵母菌临床菌株对氟康唑和伏立康唑的敏感性或耐药性并经典的M27-A3常量稀释法进行比较。结果调整电压可将白假丝酵母菌ATCC90029株活菌与死菌在流式细胞仪SS/log（ FL3）门中分为边界清晰的两群细胞,不同比例死菌与活菌混合液与流式药敏试验检测值之间有高度相关性（r＝0．999）。流式药敏试验30 min内可出结果,其最适菌液浓度为1．0×106/ml、药物与真菌最适孵育时间为3 h、最佳染色方法及时间为脱氧胆酸钠预处理后PI染色5 min。流式药敏试验与M27-A3常量稀释法对110株假丝酵母菌临床菌株对氟康唑和伏立康唑敏感或耐药总符合率分别为98．2％和87．3％。结论较之经典的常量稀释法,流式药敏试验用于检测真菌对药物的敏感性或耐药性具有快速、准确、敏感等优点,具有临床应用前景。     

问号钩端螺旋体经线粒体相关信号通路诱导巨噬细胞凋亡的研究

目的 确定线粒体相关信号转导途径在问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导小鼠单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖株诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1凋亡模型.采用透射电镜观察感染细胞线粒体病变情况,JC-1染色法检测感染细胞线粒体膜电位变化,荧光探针DCFH-DA检测感染细胞内活性氧(ROS)水平.采用试剂盒检测感染细胞caspase-8和caspage-9活性变化.流式细胞术检测感染细胞凋亡情况以及cagpage阻断剂阻断凋亡的效果.采用Western blot检测线粒体内和胞质中的细胞色素c(cytc)以及凋亡诱导因子(Air)、核酸内切酶G(EndoG)和Smac水平.应用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG从细胞质至核内的转位.结果 问号钩体赖株可诱导J774A.1细胞凋亡.感染细胞的线粒体有明显病变,线粒体膜电位降低且胞内活性氧水平升高.感染细胞caspage-8活化,caspase-9则否,但caspase阻断剂不能完全阻断细胞凋亡.感染细胞AIF和EndoG从线粒体释放至胞质并转位至细胞核内.未检测到感染细胞胞质内CytC水平升高及Smac的释放.结论 线粒体可通过非caspase途径的AIF和EndoG参与问号钩体诱导单核一巨噬细胞凋亡的过程.     

空肠弯曲菌mcp1/2/3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性

目的 克隆空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)接受甲基趋化蛋白(MCP)编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统,建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质,了解MCPs与趋化诱导物之间的关系.方法 PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段,T-A克隆后测序.构建上述目的 基因原核表达系统,SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的 重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rMCPs.rMCPs免疫家兔获得抗血清,免疫扩散法测其效价.用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG,经胃蛋白酶酶解和Sephedex G-100层析制备IgGF(ab')2.建立HAP(hard-agar plus)法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用.采用基于IgG F(ab')2封闭的趋化阻断试验,确定不同MCPs的功能及其差异.结果 PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mop3基因片段,其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs,其产量均约为细菌总蛋白的10%.rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体,其免疫扩散效价均为1∶4.牛胆汁和脱氧胆酸钠(DOC)对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用(P<0.05).MCP1和MCP2被其IgG F(ab')2 封闭后,空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱(P<0.05),MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响(P>0.05).结论 本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白.牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质,MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程.     

福尔马林灭活RSV疫苗增强性疾病模型建立及特征研究

以福尔马林灭活呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗(兀-RSV)预防接种的婴儿或学龄前儿童,自然感染RSV后较之未接种疫苗感染者表现出更为严重的支气管痉挛性肺炎[1].此类因疫苗免疫接种使相应病原微生物感染时致病作用增强的疾病或现象,称为"疫苗增强性疾病"(vaccine enhanced disease.VED).目前关于VED免疫病理调控机制的研究多建立在动物模型基础上[2].本研究通过制备FI-RSV疫苗,建立BALB/c小鼠FI-RSV相关VED模型,定义其病毒滴度、抗体水平以及病理诊断特征,为进一步研究RSV相关VED的分子机制提供实验资料.     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

封闭胸腺基质淋巴生成素受体对超敏原引起的气道炎症性应答的作用

目的为阐明胸腺基质淋巴生成素受体（Thymic stromal lymphopoietin receptor,TSLPR）在超敏原引起的气道炎症应答中的作用,并在小鼠模型中探讨局部封闭TSLPR用以缓解哮喘的可能性。方法对TSLPR抗体或同型抗体预处理,且以鸡卵白蛋白（OVA）诱导的各组小鼠,分别行气道浸润细胞的分类和记数、H＆E和PAS的肺组织染色分析;并以酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子;进一步分析OVA激发的小鼠树突状细胞（DCs）的迁移能力和成熟状态。结果在小鼠OVA致敏前施以抗TSLPR抗体可显著减少气道粘液的分泌、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润;同时引发IL-4、IL-5水平的明显下降。而作为其机制之一,TSLPR的中和作用可阻止超敏原诱导的DCs的成熟和迁移。结论封闭TSLPR介导的信号通路可缓解哮喘小鼠的气道炎症反应,有望成为一项新的防治气道变应性疾病策略。     

封闭胸腺基质淋巴生成素受体对超敏原引起的气道炎症性应答的作用(英文)

目的为阐明胸腺基质淋巴生成素受体(Thymic stromal lymphopoietin receptor,TSLPR)在超敏原引起的气道炎症应答中的作用,并在小鼠模型中探讨局部封闭TSLPR用以缓解哮喘的可能性。方法对TSLPR抗体或同型抗体预处理,且以鸡卵白蛋白(OVA)诱导的各组小鼠,分别行气道浸润细胞的分类和记数、H&E和PAS的肺组织染色分析;并以酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子;进一步分析OVA激发的小鼠树突状细胞(DCs)的迁移能力和成熟状态。结果在小鼠OVA致敏前施以抗TSLPR抗体可显著减少气道粘液的分泌、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润;同时引发IL-4、IL-5水平的明显下降。而作为其机制之一,TSLPR的中和作用可阻止超敏原诱导的DCs的成熟和迁移。结论封闭TSLPR介导的信号通路可缓解哮喘小鼠的气道炎症反应,有望成为一项新的防治气道变应性疾病策略。     

五虎汤对婴幼儿哮喘患儿外周血树突状细胞表面共刺激分子表达的影响

目的 观察五虎汤对婴幼儿哮喘患儿外周血树突状细胞（DC）共刺激分子CD80、 CD83和CD86表达的影响，为探讨五虎汤防治本病的机制提供依据。     

表皮生长因子受体跨膜区编码序列的克隆

目的：克隆表皮生长因子受体跨膜区（Transmembrane,TM）编码序列，为构建跨膜型超抗原和细胞因子的表达载体奠定基础。方法：以表达c-erb-B2癌基因的中国卵巢癌细胞系HO－8910细胞的RNA逆转录产物(cDNA）为模板，用两条针对c-erb-B2全长基因序列中编码TM区序列特异性的引物，采用RT－PCR方法克隆TM区片段并测序。结果：实验克隆的TM编码序列，经测序证实与Genbank中接受号为M11730的TM区序列完全一致；与接受号为X03363的TM区序列存在G→A的多态性。结论：成功地克隆了TM编码序列，并证实源于中国的卵巢癌细胞系HO－8910中所包含的表皮生长因子受体基因中编码的TM区序列存在多态性。     

南非蜱咬热焦痂的组织特点和免疫检测

南非蜱咬热（African tick-bite fever,ATBF）是由非洲立克次体属（R.africae）引起的立克次体病。我们对8个病人通过细胞培养及PCR阳性和血清学阳性的联合检测确定为ATBF，再从这8个患者的表皮嫁接焦痂中提取非洲立克次体，对其组织特点和免疫检测进行探究。通过大量的图象分析，我们对南非蜱咬热病人和地中海斑点热焦痂的炎症模式进行比较。