丙型肝炎病毒重组蛋白的免疫保护性

目的 研究两种HCV重组蛋白联合免疫小鼠所诱导的免疫应答及免疫保护作用.方法 用两种重组蛋白HCV-T和HCV-第一高变区多片段重组融合蛋白(F4HVR1)分别与联合免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,用ELISA方法测定血清特异性抗体;末次免疫后14 d处死5只小鼠,分离小鼠脾细胞.体外检测IFN-γ、IL-4和行CTL杀伤实验;剩余的小鼠背部皮下注射1.0×106个SP2/O-NS3细胞,观察其保护作用.组间均数差异采用LSD-t检验.结果 与PBS组相比,用HCV-T和HCV-F4HVR1联合免疫诱导了针对HCV-F4HVR1的特异性的IgG(t=3.815,3.762,P＜0.05)、高水平的HCV-NS3特异性的CTL效应(t=3.971,P＜0.05)和高水平的IL-4(t=3.813,3.426,3.671,P＜0.05)和IFN-γ(t=3.512,3.417,P＜0.05)的分泌.结论 用HCV-T和HCV-F4HVR1联合免疫小鼠可诱导出高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,能有效地预防SP2/O-NS3细胞的攻击.     

CpG和Al(OH)3佐剂联合使用增强丙型肝炎病毒重组蛋白疫苗的细胞免疫原性

目的 CpG和Al(OH)3佐剂联合使用增强丙型肝炎病毒(HCV)重组蛋白联合疫苗(TFE)的细胞免疫原性.方法 以CpG、Al(OH)3、Al(OH)3+CpG和弗氏佐剂(FA)为免疫佐剂,分别与TFE混合免疫BALB/c小鼠.末次免疫后10 d取静脉血,分离血清,用ELISA方法测定血清中特异性抗体,并每组处死5只小鼠,分离小鼠脾细胞,体外检测IFN-γ、IL-4和CTL杀伤试验;剩余的小鼠背部皮下注射1×106个SP2/O-NS3细胞,观察其保护作用.组间均数差异用LSD-t检验.结果 TFE+Al(OH)3+CpG组的特异性CTL杀伤能力高于TFE+FA组和TFE+CpG组(P<0.05);与TFE+Al(OH)3组和TFE+CpG组相比,TFE+Al(OH)3+CpG组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞的数量显著增多(P<0.05).结论 Al(OH)3和CpG合用能显著增强HCV重组蛋白联合疫苗TFE的细胞免疫原性;TFE+Al(OH)3+CpG能有效预防表达HCV非结构蛋白NS3的细胞SP2/0-NS3对免疫小鼠的攻击.     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

RNA干涉文库的设计与应用

人类基因组计划的巨大发展提供了大量原始生物学信息,但对其功能信息的了解还相当有限。RNA干涉技术为研究基因功能提供了一种快速而经济的方法。构建靶向大量基因的RNA干涉文库在基因组范围内实现基因的沉默,已成为研究细胞生物学行为的一种新的功能基因组学研究方法。近年来相继出现许多针对RNA干涉文库的设计策略,并在一定规模内成功实现遗传学筛选,为将RNA干涉文库用于功能基因组学的研究进行了意义深远地探索与尝试。     

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制肽构建及活性的初步鉴定

目的 根据丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白酶4个多肽底物切点的氨基酸序列特异性,设计1个多位点的竞争性抑制多肽序列.方法 采用中心模板法PCR合成多肽基因;利用原核高效表达载体pBVIL1在大肠杆菌HB101中,表达目的多肽;提取包涵体,用离子交换层析纯化蛋白;在体外添加到蛋白酶和NS5A-B片段构建的反应系统中,用SDS-PAGE鉴定多肽对病毒蛋白酶的抑制活性.结果 正确合成了多肽基因,重组载体pBVIL1/IP在HB101中表达了目的多肽;纯化后,获得电泳纯多肽;体外初步测定证实,随多肽浓度增加,蛋白酶底物降解受到抑制.结论 原核表达的重组抑制多肽,体外对HCV蛋白酶活性具有抑制作用.     

HCV基因分型研究进展

HCV基因型无论是对HCV的基础研究、临床治疗还是预防,都有着重要的意义.HCV的基因分型方法有很多,但都不是完善的,唯一的参比标准是HCV基因组测序.但各种方法对不同HCV领域的工作仍是必要的,目前HCV可分为11个基因型,80多个基因亚基.     

抗丙型肝炎病毒第一高变区抗体捕获HCV病毒的实验研究

目的采用抗丙型肝炎病毒（HCV）第一高变区（HVRI）抗体，建立病毒捕获实验。方法重组表达HVRI嵌合抗原，免疫家兔，制备抗HVR1抗体，与20例患者阳性血清反应，通过HCVRT—PCR检测捕获结果。结果在30例样品中有13例完全捕获，16例部分捕获，仅1例未捕获。结论抗HVRI多抗可高交叉捕获HCV病毒。     

丙型肝炎病毒第一高变区代表序列重组肽的交叉性研究

目的：研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）第一高变区（hypervariable region 1,HVR1）抗原的交叉反应性，获得适合我国HCV感染株的高交叉反应性HVR1y序列及其组合。方法：对我国报道的HVR1序列，用计算机进行同源性分析，从中选出可能具有高交叉反应的HVR1序列，也选择文献报道的具有高交叉反应性的HVR1序列或HVR1模拟肽序列。用合成基因及重组表达技术，获得一系列重组HVR1肽，并用间接ELISA法研究这些重组HVR1对我国HCV阳性血清的交叉反应性。结果与结论：本研究获得了12条重组HVR1肽抗源，用随机选择的27份我国HCV阳性血清进行交叉反应性检测，发现每条重组HVR1均和不止一份的阳性血清有反应。选择其中4条适合我国的交叉反应性较好的重组HVR1，其交叉反应率可覆盖27份阳性血清的25份（92.5％），对解决HCV疫苗研究中存在的变异问题具有重要意义。     

rhIL-1β对化疗小鼠淋巴细胞增殖的影响

一定剂量范围的环磷酰胺（ＣＹ）可使机体在一定时间内免疫功能低下，并出现一系列的并发症。白细胞介素，-１（ＩＬ－１）主要是由单核巨噬细胞产生的，近年研究发现它对多种免隆活性细胞有重要调节作用．我们以环磷酰胺注射小鼠为模型，采用ＭＴＴ比色法，观察了重组人白细胞介素－１（ｒｈＩＬ－１）对环磷酰胺注射小鼠琳巴细胞增殖的影响。实验分５组，首先３个用药组分别腹腔注射ｒｈＩＬ－１３×Ｋ１０５Ｕ／鼠、３×１０４Ｕ／鼠和３×１０ｘ３Ｕ／鼠，正常对照组及环磷酚胺对照组腹腔注射等体积的生理盐水，２０小时后，除正常对照…     

丙型肝炎病毒T细胞表位的筛选及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)不同变异株中，筛选高保守的能涵盖多种MHC限制类型的T细胞表位，并构建重组表位抗原的原核表达质粒。方法：检索文献并结合MHC限制型，从中遴选出功能明确的T细胞表位；利用Goldkey软件，建立HCV全长蛋白序列数据库；从中分别截取各个表位所在区段，对所选取的表位进行同源性比较；从中选取保守性强的部分表位，用化学法合成表位基因，插入原核表达载体pBVIL1中，构建多个融合表达质粒并在E．coli表达。结果：从文献中获得HCV免疫优势性T细胞表位18个，在由55条全长HCV序列组成的数据库中进行比较，获得了大量有关表位保守性的信息，并进行了统计分析，所构建的5个表达质粒pBVIL1—T1—T5经鉴定后，在大肠杆菌中均获得了高效表达。结论：本研究有助于深入认识HCV T细胞表位的特性，为表位的筛选提供了方法学依据，所选取的表位及原核表达的重组蛋白，为HCV治疗性疫苗的实验研究提供了候选抗原。