病毒蛋白酶的研究概况

大量的研究结果表明，病毒编码的蛋白酶参与病毒多肽前体的切割、组装和成熟，巳成为开发抗病毒药物的目标酶。本文依据近年病毒蛋白酶的研究成果，就蛋白酶种类、病毒蛋白酶、病毒蛋白酶在病毒复制中的作用及病毒蛋白酶的研究方法进行综述。     

急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。     

急性病毒性坏死病毒魁蚶株IAP-86基因全长cDNA克隆和生物信息学分析

为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus, AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染 AVNV 的濒死魁蚶外套膜中提取总 RNA,反转录获得 cDNA。根据 NCBI公布的 AVNV 全基因组序列中 ORF86序列设计两对反向套式引物,通过 cDNA 末端快速扩增(RACE)技术获得 ORF865￠端和3￠端的非编码区,拼接获得全长 cDNA 序列。Blast 序列比对显示,该基因与牡蛎疱疹病毒的同源性为100%,与栉孔扇贝 AVNV 的同源性为99%,并存在重叠基因。生物信息学分析预测,该蛋白不含信号肽,不存在跨膜区,最大疏水指数为1.800,最小疏水指数为–3.456。该蛋白存在8个潜在的磷酸化位点(包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸),存在 1个潜在的 O-糖基化位点,不存在潜在的 N-糖基化位点;其抗原表位主要集中在8?11、14?16、28?39、75?76、88?95、97?100和147?158位氨基酸。推测该株病毒可能为牡蛎疱疹病毒的变异株,并且基因重叠在该类病毒进化过程中可能扮演重要角色。     

牙鲆口服A3α-肽聚糖最佳投喂方案的选择

在前期工作基础上,本实验在普通海水鱼饲料中添加了3．84g／kg（m／m）的A3α-肽聚糖（A3α—PG）,采用不同的投喂方案作用于牙鲆。以生长、溶菌酶、补体旁路激活活力（ACH50）、吞噬为评价指标,在实验期间的第14、28和42天分别取样进行测定,以评价不同投喂方案下肽聚糖制剂对牙鲆非特异性免疫力的影响。结果显示,14d内未见生长的明显差异,而在28d和42d后,4d投喂肽聚糖饲料＋3d投喂空白饲料（简称“4＋3”组）和7d投喂肽聚糖饲料＋7d投喂空白饲料（简称“7＋7”组）促生长效果最为明显（P〈0．05）。溶菌酶活力在前14d内以“4＋3”组活力最强,至28d后各实验组活力基本一致,42d时,除“7＋7”组外,各组均比对照组有明显提高（P〈0．05）。ACH50活力以1d肽聚糖饲料＋1d空白饲料（简称“1＋1”组）活力最强,在整个实验过程中均比对照组表现出大幅提高（P〈0．05）。吞噬活力在不同时间不同投喂方式下所表现出的水平有一定的波动,但从整体来看,以“4＋3”组对其诱导能力最强,前14天内,“4＋3”组与对照组及其他组相比未见明显提高,但在28d后其活力值上升较快,且维持到42d仍有较高水平。综上所述,从不同投喂方案对生长及非特异性免疫力的调节能力,并结合经济性与实用性来考虑,建议采用“4＋3”的间隔投喂方案给予牙鲆A3α-肽聚糖,以提高其非特异性免疫力和抗病力。     

美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾非特异性 免疫功能及抗病力的影响

在基础饲料中分别添加0.1%和1%美人鱼发光杆菌灭活菌、0.1%美人鱼发光杆菌活菌配制成3种免疫实验饲料,以基础饲料为空白对照组饲料,每组设3个平行样。对个体质量为(4.83±0.36)g的凡纳滨对虾进行为期20 d的饲养实验,分别在0、5、10、15和20d进行取样,以血清中的酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(UL)活性为免疫指标,探讨了美人鱼发光杆菌作为免疫制剂对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的影响;在投喂免疫饲料后的第22天,按0.004 2 kg/kg体重的剂量,直接投喂对虾白斑综合征病毒(WSSV)病料,并记录累积死亡率。结果表明,美人鱼发光杆菌免疫实验组对凡纳滨对虾血清中PO、ACP、AKP、UL和SOD活性影响明显高于对照组,并且在饲料中添加美人鱼发光杆菌后,明显提高了对虾抵御WSSV感染的能力。其中0.1%美人鱼发光杆菌活菌实验组的抗病毒感染能力最强,WSSV感染14d内累计死亡率为63.3%±5.8%;而对照组为96.7%±3.3%。研究表明,美人鱼发光杆菌添加在对虾饲料中能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平,增强抵抗疾病的能力,将其作为对虾免疫增强剂具有良好的应用前景。     

豆粕的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)发酵工艺优化及其营养成分分析

坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) PC024是一株分离自中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)养殖环境,且能够提高对虾免疫力和抗病力的益生菌.本研究优化其发酵豆粕的工艺条件,单因素优化结果:最佳接种量为2× 106 CFU/g,最佳料水比为1∶0.8,最佳发酵时间为90 h,最佳发酵温度为37℃.在单因素实验结果的基础上,采用响应面法对4个因素进行了优化,最终确定最佳发酵条件:发酵温度为39.0℃,发酵时间为100 h 18 min,料水比为1∶0.96,接种量为3.84× 106 CFU/g.经此条件发酵后,发酵产物中的菌浓度可达1.23×1010 CFU/g,验证值与预测值相差5.13％,优化模型可靠.豆粕经发酵后发生感官变化,豆粕发酵的得率为(93.89±0.01)％,可溶性蛋白含量由发酵前的(39.16±0.01)％增加到(58.80±4.54)％,豆粕粗蛋白质由发酵前的50.71％增加到55.03％,15种氨基酸的总含量增加到原来的132.30％,增加比例最大的5种为精氨酸(168.60％)、赖氨酸(157.20％)、丝氨酸(152.50％)、苏氨酸(139.04％)和甘氨酸(138.40％).经SDS-PAGE显示,蛋白大分子得到有效降解.本研究可为益生菌的利用和对虾疾病防控提供新思路.     

白斑综合征病毒卵黄抗体对凡纳滨对虾免疫相关酶活力和抗病毒能力的影响

摘要：免疫活性物质可以调动或激活虾类自身的免疫系统，提高动物的免疫机能，增强动物的抗病毒能力。有关卵黄抗体对对虾体内酶活力及抗病毒能力的影响，国内外尚未见报道。本实验通过连续投喂的方法，用3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard(shrimp)制成的试验饲料，同时以基础饲料为空白对照饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 20 d，分别测定了第5，10，15，20 d血淋巴的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(UL)、酸性磷酸酶(ACP)及肌肉匀浆液的超氧化物歧化酶(SOD)等非特异性免疫因子活性，并对血清及肌肉匀浆液中蛋白进行定量。结果表明，免疫组的PO、UL、ACP、SOD活力均显著高于对照组(P<0.05)。免疫20 d后，用白斑综合征病毒(WSSV)投喂感染。攻毒后第7 d各免疫组的相对免疫保护率分别为17.95%、23.08%、35.90%。实验结果说明，Ig-Guard(shrimp)能有效提高对虾免疫因子的活性，对于提高抗WSSV感染能力也有一定作用。将对虾免疫因子活性和累计死亡率协同分析，摄食低浓度Ig-Guard(shrimp)组较之高浓度组的酶活力高，其累计死亡率低，故笔者建议适当地投喂低浓度Ig-Guard(shrimp)更为合理。     

饲料中补充蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)生物膜对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响

为了研究外源补充蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)生物膜对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、抗病力及对其肠道微生物组成的影响,以基础饲料为空白组,在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌游离态活菌作为游离态组(活菌含量为108 CFU/g);在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌活菌生物膜作为生物膜组(活菌含量为108 CFU/g);每组8个平行.在养殖大棚暂养7d后,对凡纳滨对虾进行40 d的养殖实验.在第17天进行白斑综合征(White Spot Syndrome Virus,WSSV)攻毒实验;第22天进行副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒实验.期间在第1、5、10、15天采样,称重并测量体长计算生长速率.在第1、5、10、15、20、25天采样,并取其肠道内容物提取DNA,用16S rDNA序列V3+V4区高通量测序方法检测对虾肠道内微生物群落的结构及变化情况.结果显示,生物膜组和游离态组对虾体重、体长增长速率高于空白组,生物膜组与游离态组对虾体重、体长差异性不显著,生物膜组和游离态组对虾体重、体长与空白组相比差异性显著.实验中凡纳滨对虾肠道微生物由变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等组成,其中,变形菌门平均占到总量的94.0％.变形菌门中主要以弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、Octadecabacter等为主,生物膜组、游离态组、空白对照组弧菌属平均含量分别为34.65％、39.27％、58.00％.在WSSV攻毒实验中,生物膜组、游离态组、空白对照组平均累积死亡率分别为80.0％、77.0％、92.0％,各组差异性不显著(p＞0.05).在副溶血弧菌攻毒实验中,生物膜组、游离态组、空白对照组平均累积死亡率分别为61.3％、75.0％、77.3％,生物膜组与游离态组和空白对照组相比差异性显著(P＜0.05).研究表明,饲料中添加蜡样芽孢杆菌生物膜和游离态蜡样芽孢杆菌投喂凡纳滨对虾后,可改变对虾肠道的微生物组成,提高凡纳滨对虾生长速度、增强抗病能力,而且添加蜡样芽孢杆菌生物膜效果最明显.     

饲料中补充蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长及其肠道微生物组成的影响

为了研究外源补充蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长及对其肠道微生物组成的影响,以基础饲料为空白组,在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌活菌作为实验组(活菌含量为108 CFU/g),每组4个平行,在养殖场对凡纳滨对虾自幼苗至成虾进行一个完整养殖周期的养殖实验。选取养殖场中8个光照、位置等条件基本相同的养殖池分为2组,空白组投喂基础饲料,实验组投喂免疫饲料,养殖周期95 d。期间在第45、52、59、66、73天采样,称重并计算生长速率,并取其肠道内容物提取DNA,用16S r DNA序列V4区高通量测序方法检测对虾肠道内微生物群落的结构及变化情况。结果显示:(1)投喂免疫饲料的实验组对虾生长速度比空白组平均快15.2%。(2)健康的凡纳滨对虾肠道微生物以变形菌门和拟杆菌门含量高,厚壁菌门、疣微菌门、浮霉菌门、放线菌门含量较低。(3)空白组变形菌门平均含量(68.30%),明显高于实验组平均含量(57.94%);空白组拟杆菌门平均含量(23.58%)明显低于实验组平均含量(30.06%)。(4)变形菌门中以弧菌属、Anaerospora、小红卵菌属为主,空白组弧菌属平均占总含量的5.40%,实验组平均占总含量的1.94%;拟杆菌门中以异养硝化菌属、粘着杆菌属为主,实验组异养硝化菌属平均占总含量的8.12%,空白组平均占含量的5.56%。研究表明,饲料中添加蜡样芽胞杆菌投喂凡纳滨对虾后可改变对虾肠道的微生物组成,提高对虾生长速度。