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该研究旨在克隆变形假单胞菌JUIM01的2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因kgu T,并明确其基本的生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组信息及其2-酮基葡萄糖酸操纵子的物理图谱设计简并引物,采用TD-PCR技术从变形假单胞菌中克隆到全长为1278 bp的kgu T,其核苷酸序列与Pseudomonas sp.CCOS191的编码2-酮基葡萄糖酸转运蛋白(Kgu T)的核苷酸序列的一致性为87%,编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白与Pseudomonas sp.M1的Kgu T在氨基酸序列上的一致性达90%,定位于细胞膜,是一个具有12个跨膜结构的疏水性的跨膜蛋白,无信号肽,其二级结构中α螺旋、延伸链和无规卷曲所占的比例分别为75.76%、2.12%和22.12%。本研究首次从2-酮基葡萄糖酸的工业生产用菌中克隆到基因kgu T,并对其进行了生物信息学分析,为变形假单胞菌的Kgu T的功能研究奠定了基础。 相似文献
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经超声破碎细胞、TritonX-114相分离、盐析、DEAE-sepharose离子交换层析和Hydroxyapatite吸附层析等步骤,从2-酮基葡萄糖酸(2-keogluconic acid,2KGA)生产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活力91.43 U/mg、纯化倍数160.4 倍的膜结合葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase,GADH)。研究结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH由3 个亚基组成,其分子质量分别为65.0、45.0 kDa和23.0 kDa左右,是一种含有细胞色素C的黄素蛋白,能够催化氧化葡萄糖酸为2KGA。粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH 5.0,在30 ℃以下、pH 5.0~6.0的条件下较为稳定;该酶具有严格的底物特异性,只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33 mmol/L;一些金属离子(如Fe3+、Cu2+和Zn2+)、有机溶剂(乙醇、异丙醇、甲醇和丙酮)、变性剂(十二烷基硫酸钠和巯基乙醇)以及有机酸(草氨酸和草酸)对膜结合GADH的催化活性具有明显的抑制作用。研究为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供了一定的理论依据。 相似文献
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