Inhibitive effects of glucose and free fatty acids on proliferation of human vascular endothelial cells in vitro

Objectives To investigate the effects of glucose and free fatty acids (FFAs) on the proliferation and cell cycle of human vascular endothelial cells in vitro , and to examine whether the combined presence of elevated FFAs and glucose may cross-amplify their individual injurious effects.Methods Cultured human vascular endothelial cells (ECV304) were incubated with various concentrations of glucose and/or FFAs (palmitate and/or oleate) for 24-96 h. Morphologic alterations were observed using a phase contrast microscope and an electron microscope. Inhibition of proliferation was measured by a colorimetric 3-［4, 5-dimethyl thiazol-2-yl］-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Cell viability was determined using trypan blue exclusion. Distribution of cells along phases of the cell cycle was analyzed by flow cytometry. Results Glucose 15 or 30 mmol/L, palmitate (PA) 0.25 or 0.5 mmol/L, and oleate (OA) 0.5 mmol/L inhibited proliferation and accelerated death of endothelial cells in a dose-and-time-dependent manner. After treatment with elevated glucose and/or FFAs, the G(0)/G(1) phase cells increased, whereas S phase cells decreased, suggesting that high glucose and/or FFAs mainly arrested endothelial cells at G(0)/G(1) phase. The inhibitive rates of proliferation and population of dead cells in endothelial cells incubated with glucose plus FFAs (glucose 30 mmol/L+PA 0.25 mmol/L, glucose 30 mmol/L+OA 0.5 mmol/L, glucose 30 mmol/L+PA 0.25 mmol/L+OA 0.5 mmol/L) increased more markedly than those treated with high glucose or FFAs (PA and/or OA) alone. Conclusion Both high ambient glucose and FFAs can inhibit proliferation and accelerate death of endothelial cells in vitro. These changes were cross-amplified in the combined presence of high levels of glucose and FFAs.     

人内皮细胞一氧化氮合酶红色荧光蛋白报告基因载体的构建与表达

目的：研究血管壁切应力诱导的人血管内皮细胞内皮细胞-氧化氮合酶（eNOS）基因表达的调控机制,构建在哺乳动物细胞中表达的eNOS红色荧光蛋白报告基因载体。方法：从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子,将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRedl-l上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后将重组载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达和分布情况。结果：PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDseNOSRed的构建正确,该载体能在293细胞中高效表达。由eNOS启动子驱动表达的红色荧光蛋白大部分均匀分布于整个细胞中,转染后12h开始出现,36-48h为表达高峰,120h后红色荧光几乎全部消失。结论：成功构建了eNOS红色荧光蛋白报告基因载体,该载体能在哺乳动物细胞中高效表达,为研究血管壁切应力诱导血管内皮细胞eNOS基因表达的调控机制提供了一个重要而又方便的工具。     

Lipopolysaccharide upregulates the expression of Toll-like receptor 4 in human vascular endothelial cells

目的：探讨内皮细胞TLR2和TLR4的表达以及内毒素对其表达的影响。方法：按RNA提取试剂盒说明书提取内毒素作用后的ECV-304(人脐静脉内皮细胞株)和人脐静脉内皮细胞总RNA,运用逆转录PCR(RT-PCR)检测细胞TLR2和TLR4mRNA的表达。结果：人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞株均能表达TLR2和TLR4mRNA,但是,TLR4的表达水平明显强于TLR2的表达,LPS能明显上调TLR4的表达,但对TLR2的表达无影响。结论：本研究提示TLR4能明显上调LPS作用的信号转导分子,在LPS对内皮细胞的激活效应中具有重要的作用;ECV-304是内皮细胞研究的良好的实验模型,可代替人脐静脉内皮细胞而较为广泛应用。     

胚胎干细胞系向造血干细胞定向分化的研究

目的：建立并稳定和优化诱导胚胎干细胞（ES）向造血干细胞定向分化的方法。方法：应用体外胚胎干细胞分化系统,观察了多种因素对原始细胞成集落细胞（BLast Colony-Forming,Cell,BL-CFC)形成集落的影响。结果;植入不同数量的3.5d胚体衍生的细胞与BL－CFC集落生成数量之间呈高度相关,大约每植入100个3.5d胚体衍生的细胞,能生成1.08-1.2个BL－CFC集落;20％与30％浓度的D4T条件培养液促BL－CFC集落生成作用的效率最高 ;单用D4T条件培养液,EPO或KL对BL－CFC集落的生长无明显促进作用（P＞0．05）;但单用VEGF对BL－CFC集落的生成有极显著的促进作用（P＜0．001）。但当这四种因素两两组合使用时,均比单用VEGF具有明显的促BL－CFC集落生成作用。在VEGF＋KL＋D4T合用的基础上加用EPO,则促BL－CFC集落生成作用大大增强,与其它各组,BL-CFC集落数极显著地增多（P＜0．001）。大约每植入100个3.5d胚体衍生的细胞,能生成1.5-1.6个BL－CFC集落。结论：影响BL－CFC生长的主要因素可能为VEGF;D4T条件培养液具有强大的协同作用;EPO和KL为诱导BL－CFC向造血细胞系分化的主要因素;3.5d胚体衍生的细胞比3.25d胚体衍生的细胞对各种刺激因子反应更敏感,生成BL－CFC的能力更强。原始细胞成集落细胞实验（BL－CFC）可能代表了最原始造血干细胞的检测方法。     

TNF—α或mmLDL对人脐静脉内皮细胞PAI—1的细胞及其机制

目的：探讨肿瘤坏死因子α（TNF－α）或弱氧化修饰低密度脂蛋白（mmLDL)对人脐静脉内皮细胞（HUVECs)PAI－1活性和mRNA表达的影响及其分子机制。方法：用发色底物法测定HUVECs培养液中PAI－1的活性,用Northern印迹分析法检测PAI－1基因mRNA的表达情况,并分别用蛋白激酶C（PKC）或促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）抑制剂干预上述诱导实验。结果：TNF－α或mmLDL作用HUVEC后,PAI－1活性和mRNA基因表达均明显增加,促分裂原活化蛋白激酶－激酶（MAPKK）的抑制剂PD98059（60μmol/L)能明显阻断TNF－α（100U／ml)或mmLDL(50μg/ml)对PAI－1活性和mRNA的诱导,但PKC的抑制剂Staurosporine(10nmoo/L)和H7（15μmol/L)无显著阻断作用。结论：（1）TNFα或mmLDL能增强血管内皮细胞PAI－1尖性与mRNA表达;（2）PAI－1活性提高与其mRNA表达增加有关。（3）MAPK途径可能在TNF-α或mmLDL诱导血管内皮细胞PAI－1表达中起重要作用。     

食管鳞癌血管内皮细胞生长因子表达与预后的关系

背景与目的：血管形成在肿瘤的生长、侵润、转移中起着重要作用。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为是最关键的血管形成因子,研究发现在多种肿瘤中VEGF表达水平增高可促进肿瘤的进展并影响其预后,但VEGF与食管鳞癌患者预后之间的关系仍不清楚。本文拟探讨VEGF的表达在判断食管鳞癌患者预后中的价值。方法：采用免疫组化法检测72例食管鳞癌手术切除标本中VEGF蛋白的表达情况,并对其与术后复发转移以及预后间的关系进行回顾性分析。结果：全组病例VEGF表达的阳性率为62．5％（45／72）;VEGF阳性组的术后复发转移率高于VEGF阴性组（P＜0．001）;VEGF阳性组患者的中位生存时间以及1、3、5年生存率均低于VEGF阴性组,VEGF阳性组的Kaplan-Meier生存曲线较阴性组恶劣（Log rank test,P=0.021);多因素分析表明VEGF不是影响预后的独立因素（P＞0．05）。结论：VEGF表达水平增高可提示食管鳞癌发生转移的机会增加以及预后恶劣,但对判断患者预后中的价值有待于进一步研究。     

γ射线照射对两种组织修复细胞的直接效应与W11-a12的作用

目的 探讨电离辐射是否对成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖游走功能具有直接抑制作用及其抑制程度,以及W11－a12的促愈使用。方法 采用培养的单层3T3细胞（小鼠胚胎FBs株）和培养的单层ECV304细胞（人脐静脉内皮细胞株）划痕伤口模型进行离体照射,观察痕隙闭合速度。结果 在6Gy照射后培养的单层3T3细胞与单层L－ECV304细胞划痕“伤口”闭合明显延缓。单层3T3细胞在伤后10h对照组伤口完全闭合,而照射组仅闭合77％;照射组单层ECV304细胞在伤后12h仅为对照组的83．6％。W11-a12用药组对单层3T3细胞与ECV304细胞“划痕”伤口的闭合均有促进作用。结论 放射损伤对成纤维细胞与血管内皮细胞的增殖游走有直接抑制作用,这是伤口难愈的重要原因之一。促进伤口细胞游走和增殖是W11－a12作用的一个重要途径。     

血栓性微血管病的诊治进展

血栓性微血管病(Thrombotic Microang-iopathy,TMA)是一组微血管阻塞性疾病,其特征是全身性或肾脏内血小板聚集、血小板减少和红细胞机械性损伤直至微血管血栓形成,主要包括血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura,TTP)和溶血性尿毒症综合征(Hemolytic Ur     

大鼠角膜酸烧伤对角膜内皮细胞损伤和修复的实验观察

目的研究大鼠角膜酸烧伤对内皮细胞的损伤和影响内皮修复的因素.方法建立轻、中、重度大鼠角膜酸烧伤模型,裂隙灯下动态观察角膜水肿、混浊及上皮愈合情况;各组于烧伤后不同时间点取角膜行内皮细胞台盼蓝-茜素红联合活细胞染色及HE染色,观察内皮细胞损伤、修复及白细胞浸润情况.结果轻、中度酸烧伤角膜内皮细胞未见损伤改变,角膜少量白细胞浸润,上皮愈合及水肿消退均较快;重度酸烧伤损伤区内皮细胞坏死、脱落,修复期损伤周边区内皮细胞变形、伸长,向创面移行,角膜大量白细胞浸润,角膜上皮愈合延迟,水肿消退慢.结论重度酸烧伤可直接造成角膜内皮细胞受损,继发性炎症反应参与了酸烧伤后角膜内皮细胞的损害;内皮细胞受损可使角膜溃疡及水肿迁延不愈.     

血管内皮生长因子与脑血管病

血管内皮生长因子（Vascular　endothdial　growth　factor，VEGF）最早于1989年由Ferram等从牛脑垂体呈状胶质细胞体外培养液中分离并提纯出的一种糖蛋白，可特异性地促进血管内皮细胞生长，故称为血管内皮生长因子。后发现血管通透因子（VPF）也具有VEGF的活性，经蛋白质测序和基因分析发现，二者实际为同一基因不同剪切方式所产生的系列产物。故又称为血管通透性因子。