结缔组织生长因子的表达调控研究进展

结缔组织生长因子是新发现的一种细胞因子 ,在促进组织器官纤维化方面起重要作用。近来发现CTGF表达受许多因素调控 ,包括 :TGFβ、VEGF、TNFα、切线应力、H2 O2 、CTGF启动子上特殊的转录因子结合位点及 3’端非翻译区调节序列等。对其的基因表达调控的进一步研究 ,将为抗纤维化治疗策略提供新思路。     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。     

子宫内膜癌组织中p16 mRNA及P16蛋白的表达

①目的　探讨抑癌基因 p16与子宫内膜癌发生、发展的关系。 ②方法　应用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和免疫组织化学技术 ,对 4 2例子宫内膜癌及 15例正常子宫内膜组织中 p16mRNA及P16蛋白进行检测 ,并结合临床病理特征进行分析。③结果　子宫内膜癌组织中p16mRNA及P16蛋白的阳性表达率分别为6 9.0 5 %和 5 9.5 2 % ,显著低于正常组织 (χ2 =6 .0 15、8.6 2 5 ,P <0 .0 5 )。p16mRNA及P16蛋白的表达缺失与肿瘤的组织学类型无关 (χ2 =0 .10 0、0 .2 94 ,P >0 .0 5 ) ,而与组织学分级和临床分期有关 (χ2 =3.95 4、6 .873,P <0 .0 5 )。④结论　p16mRNA和P16蛋白的表达缺失在子宫内膜癌的发生和发展中可能起重要作用     

脂多糖刺激树突状细胞前后TLR2、3、4基因表达的检测

目的 检测脂多糖作用于树突状细胞前后TLR2、3、4基因的表达情况。方法 从外周血分离单核细胞，加入rhGM-CSF及rhIL-4，培养的第6天，实验组加入脂多糖刺激24h，对照组不加。分别提取细胞总RNA，行半定量RT-PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果 单核细胞经GM-CSF及IL-4诱导7d后的DC表达较高水平TLR2、3、4。脂多糖刺激24h后，TLR2、3、4表达下降，TLR4几乎测不到。结论 树突状细胞在受脂多糖刺激前后TLRs的表达有显著变化，推测和它的功能成熟有关。     

抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白，观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C22（PA317/PST）产生的病毒上清转导入T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，采用PCR，RT-PCR，细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法，对转导的Hut-78细胞进行DNA，mRNA及蛋白水平的分析。转导的Hut-78细胞分别与SMMC-7721，HHCC共培养，MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用。结果 PCR，RT-PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带，neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号，其阳性率约为95%，鼠抗人TNF-α多克隆抗体免疫组织化学染色，转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号，MTT法检测结果，分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为15.4%和26.5%。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达，其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性，并且具有一定的体外杀伤作用。     

TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化

目的；克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex），构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法：抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞，用RT－PCR、巢式－PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA，并克隆到pGEM-T Easy载体中，DNA测序鉴定，将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T，构建重组表达质粒pGEX/TRAILex，用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段，GST－Agarose 4B层析柱纯化GST－TRAILex融合蛋白，Western-blot鉴定纯化产物。结果：抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达，成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因，构建了重组表达载体pGEX/TRAILex，IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段，经12％SDS－PAGE分析，可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达。Kodak软件分析表达GST－TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％，进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达，用GST－Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清，每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST－Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论：成功地克隆了人TRAIL基因，并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段，为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

肺癌患者FLK-1、LRP和MDR1的表达与临床研究

目的:探讨血管内皮生长因子受体 (Flk 1),肺耐药蛋白 (LRP)基因以及多药耐药基因 (MDR1)蛋白与肺癌患者临床及病理指标的关系。方法:用免疫组化技术(ABC法)对原发性肺癌组织中三种基因的表达进行检测。结果: 70例肺癌中,非小细胞肺癌MDR1阳性率 49. 2% (29 /59),明显高于小细胞肺癌 (SCLC) 18. 2% (2 /11)(P<0. 05);非小细胞肺癌LRP阳性率 69. 5% (41 /59),明显高于小细胞肺癌 27. 3% (3 /11) (P<0. 05)。腺癌中MDR1与LRP的表达明显高于鳞癌(P<0. 05)。LRP与Flk 1在NSCLCs中共同表达 49. 2% (29 /59),LRP的表达与肺癌的组织学分级相关,MDR1和LRP的表达与肺癌的组织学类型有关,Flk 1与TNM分期相关,均有统计学意义(P<0. 05)。Flk 1 LRP均阳性、FLK 1 LRP MDR1均阳性、中药治疗、复发与患者的生存率有关(P<0. 05)。结论:FLK 1、LRP和MDR1基因蛋白产物的检测对肺癌患者的诊治和预后评估有积极意义。     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

5-脂氧合酶在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达

目的 探讨5-脂氧合酶(5-LO)在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达。方法 分离大鼠腹腔巨噬细胞培养一定时间，用高效液相色谱、Western blot和RT—PCR分别观察5-LO催化的代谢产物的生物合成、5-LO和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)表达的变化，并用毛细管电泳定量分析RT—PCR产物。结果 体外培养24h对5-LO以及FLAP的表达没有明显影响，5-LO酶活性没有明显的变化；培养到第72小时，5-LO mRNA和蛋白表达没有明显的影响，但FLAP几乎检测不到，mRNA的量明显降低，检测不到白三烯B4(LTB4)和5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)。进一步培养到第120小时，5-LO的mRNA和蛋白表达明显下降，FLAP的mRNA和蛋白检测不到。毛细管电泳定量分析结果显示，培养1、24和72h，5-LO的相对表达量没有明显变化，培养到120h则下降了约80％。结论 5-LO可以在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中稳定表达72h。     

抑癌基因ING1在胃癌组织中的表达及其意义

目的 探索ING1在胃癌组织中的表达及其意义。方法 采用免疫组化法检测51例胃癌组织及15例正常胃粘膜中p33^ING1b的表达情况。结果 p33^ING1b在胃癌组织中的表达率为41．2％(21／51)。远低于在正常胃粘膜中的表达率100％(15／15)。结论 ING1是抑癌基因，其蛋白产物p33^ING1b在胃癌组织中低表达，对胃癌的发生、发展可能起重要作用。