小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建

背景：血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制，小鼠E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulatedgenes，CREG）可以抑制血管平滑肌的增殖，成为心血管领域新的治疗靶点。目的：构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体，下调小鼠细胞中cREG基因的表达。设计、时间及地点：观察性实验，于2007-04／10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成。材料：小鼠成纤维母细胞系（NIH3T3）由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠。方法：应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA。通过化学合成法合成并克隆至pEN_mHlc载体中，与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs。应用Lipofectamine^TM 2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。主要观察指标：应用反转录聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测cREG的沉默效率。结果：经酶切和DNA测序证实，4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确。反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实，4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降，稳定转染pDS-shCREGl的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87％和70％。结论：成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体，使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低。     

贮存红细胞膜氧化损伤与抗氧化酶的保护作用

对过氧化引起红细胞膜损伤进行了实验研究。结果表明:红细胞经超氧化物阴离子氧化后,其损伤表现为高分子蛋白质交联聚合物形成,共轭二烯水平增加,红细胞贮存损伤亦呈类似特征。抗氧化酶可阻抑蛋白质交联聚合物的形成并对膜损伤有一定的保护作用。     

小鼠胚胎背主动脉发育过程中内皮和平滑肌标志物表达时相及其变化

目的:观察小鼠胚胎发育过程中背主动脉胎肝激酶1、α-平滑肌肌动蛋白的表达时相,初步探讨背主动脉内皮和平滑肌细胞的形成及其可能起源。方法:实验于2006-01/2007-01在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所心内科完成。①实验材料:昆明种小白鼠50只,体质量20～22g,其中雌鼠30只。②实验方法:将雌鼠分别放入公鼠笼内过夜、交配,从怀孕第8.5天开始获取胚胎,在雌鼠怀孕第8.5～18.5天,每一时间点取10个小鼠胚胎。③实验评估:对胎鼠组织切片分别行苏木精-伊红染色,观察背主动脉形态学变化;免疫组织化学染色法观察内皮细胞标志物胎肝激酶1、CD31、Ⅷ因子相关抗原,α-平滑肌肌动蛋白表达变化及其相互关系。结果:①胚胎8.5～9.5d胎鼠背主动脉由单层细胞构成,呈胎肝激酶1、CD31阳性,α-平滑肌肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原阴性。②胚胎10.5d胎鼠背主动脉仍为单层细胞,但胎肝激酶1、CD31、Ⅷ因子相关抗原、α-平滑肌肌动蛋白均呈阳性。③胚胎11.5d背主动脉管壁发育为多层,内层细胞呈胎肝激酶1阳性、α-平滑肌肌动蛋白阴性,外层细胞呈胎肝激酶1阴性而α-平滑肌肌动蛋白阳性,血管与周围间充质无明显分界,背主动脉管壁周围可见散在α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞。④11.5d之后,背主动脉管壁平滑肌细胞数量增多且由不规则型转变为纺锤型,内层内皮细胞继续呈胎肝激酶1阳性、α-平滑肌肌动蛋白阴性,外层平滑肌细胞胎肝激酶1阴性、α-平滑肌肌动蛋白阳性,血管与周围间充质分界清楚,背主动脉血管周围无散在α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞。结论:胚胎背主动脉的平滑肌细胞可能最早起源于胎肝激酶1、CD31阳性细胞,后期可能来源于周围间充质细胞的募集分化。     

基质金属蛋白酶1基因-519A/G多态性与冠心病发病的关系

目的 研究中国北方汉族人群中基质金属蛋白酶1(MMP1)基因-519A/G单核苷酸多态性与冠心病发病的关系.方法 采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性技术结合琼脂糖凝胶电泳和基因测序等方法,检测经冠状动脉造影证实的517例冠心病患者和380例健康对照者MMP1-基因-519A/G多态性位点的基因型和等位基因分布,分析两组人群MMP1基因型和等位基因型频率的差异.结果 中国北方汉族人群中存在MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性.MMP1基因-519A/G单核苷酸多态的AA基因型在冠心病组和对照组间的分布差异有统计学意义[67.70%(350/517)比40.26%(153/380),OR=1.64,P＜0.001,95%CI:1.44～1.86],A等位基因携带者冠心病发病的相对危险度为1.49(P＜0.001,95%CI:1.33～1.69).亚组分析显示,AA基因型在急性冠状动脉综合征(ACS)组和稳定性心绞痛组间的分布差异有统计学意义[68.81%(278/404)比51.76%(44/85),P＜0.01,95%CI:1.04～1.27].A等位基因携带者发生ACS的相对危险度为1.11(P＜0.05,95%CI:1.01～1.21).不稳定性心绞痛组与急性心肌梗死组比较,AA基因型和A等位基因的分布差异无统计学意义.结论 中国北方汉族人群中存在MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性.MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性与冠心病的发病相关,A等位基因携带者发生ACS的危险性增加.     

人CREG融合蛋白基因的构建、表达及钝化

目的EIA激活基因细胞阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是新近被发现的可能具有促进细胞分化、抑制细胞增殖作用的基因.本研究拟构建含hCREG基因的原核表达质粒,在E.coli中表达GST-hCREG融合蛋白,通过凝胶层析纯化GST-hCREG蛋白,为进一步研究hCREG与人血管平滑肌细胞分化与增殖的关系创造条件.     

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制，采用PCR扩增的CREG片段插人pGEX-4T-1原核表达载体，纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体；以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型，[^3H]标记脱氧胸苷掺人法测定去血清培养HITASY细胞DNA合成变化；Western blot观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM仅α-actin、calponin的表达，RT-PCR和Western blot分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化；免疫组化观察CREG在细胞内的表达及定位。结果成功地构建了载体并得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长，除SM α-actin和calponin表达逐渐上调之外，CREG mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后，CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论：去血清能促使HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换，同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。     

116例冠心病合并慢性肾功能不全患者经皮冠脉介入治疗的回顾分析

为探讨冠心病合并慢性肾功能不全患者经皮冠脉介入治疗 (PCI)的临床特点 ,作者回顾性分析了 116例合并慢性肾功能不全和 35 2例肾功能正常的冠心病患者的临床特点及PCI治疗情况。结果显示 ,肾功能不全组饮酒、急性心肌梗死、高血压、糖尿病比例及术后住院天数、平均住院天数、平均病变支数均明显高于对照组 ,高密度脂蛋白水平、手术时间和造影剂用量明显低于对照组 (P <0 0 5 ) ;两组冠脉病变分布、平均支架数相似 ,PCI并发症及再狭窄发生率无显著差异。提示冠心病合并慢性肾功能不全患者致动脉粥样硬化因素较多 ,经围术期调整治疗可耐受PCI治疗 ,且术后效果良好。     

升结肠在可控性尿流改道中的应用（附34例报告）

自1994年10月至1998年8月对34例全膀胱切除患者分别施行可控性回结肠膀胱术(Indiana Pouch)和升结肠原位可控膀胱术。随访结果表明：取用升结肠建立的新膀肫具有容量大、内压低、无返流、无电解质紊乱等优点，两种手术方式均可自由控制排尿，极大提高了患者的生活质量。