人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。     

基因治疗进展与展望—磁性转染

基因输送是基因治疗中非常关键的技术,作为运载工具,非病毒载体可避免病毒载体的安全性等问题.近年来非病毒基因载体的开发颇受关注,许多新的物理化学技术应运而生,磁性纳米颗粒介导的基因转染即磁性转染(magnetofection)是其中极具运用前景的技术之一.     

LPS刺激后小鼠巨噬细胞Toll样受体(TLR)4及肿瘤坏死因子α表达的变化(英文)

革兰阴性菌败血症休克的发生主要是因为免疫系统对细菌LPS应答,产生过量细胞因子和炎性介质从而引起组织和器官损害。研究发现与果蝇Toll蛋白类似的哺乳动物Toll样受体家族在宿主防御中起重要作用,其中TLR4介导针对LPS的免疫应答。它们对病原体的保守结构产生应答并且激活单核细胞和中性粒细胞产生细胞因子和炎性介质。本研究观察LPS刺激后体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4表达及最重要的炎性细胞因子之一的肿瘤坏死因子α分泌水平的变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞(Mφ),细胞分为6组,分别加入LPS使其终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml,5%CO2,37℃孵育2h。流式细胞术测定Mφ表面TLR4的表达。同时取培养液上清采用ELISA方法检测TNFα。实验重复三次。结果①经0.01μg/mlLPS刺激的MφTLR4-PE阳性率与0μg/mlLPS组相比,P<0.05。其它浓度刺激组TLR4阳性率则与对照组无差异,P>0.05。Mφ细胞TLR4MFI随着LPS浓度的升高而增强,除了10μg/mlLPS组,其余各组MFI与对照组相比,P<0.05。②随着LPS浓度增加,...     

大胚龄人神经干细胞长期冻存后的复苏培养

目的探讨长期冻存后的大胚龄人胚神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的生长及其生物学特性。方法分别于冻存后6、12及24个月,快速解冻复苏胚龄为16～20周的胎脑细胞,采用无血清培养液悬浮培养,观察培养细胞的活性及成球时间,采用免疫细胞化学方法鉴定这些细胞球及其分化成熟后的细胞表面标志。结果培养传代的细胞透亮﹑成球时间短,与取自新鲜胎脑的神经干细胞无明显区别。细胞球Nestin染色阳性,成熟分化后神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及2＇,3＇-环腺苷酸-3＇-磷酸二酯酶（CNPase）抗原呈阳性。结论长期冻存后的人大胚龄神经干细胞仍具有较强增殖能力及多分化潜能。     

定向诱导的骨髓基质细胞移植后在大鼠缺血脑组织中的分布

目的探讨人骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）源神经细胞体内移植后的分布状况。方法采用密度梯度离心结合贴壁分离法分离、纯化人MSCs。MSCs经bFGF预诱导24h及阿魏酸钠（Sodium Ferulate）诱导24h后用于移植。采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注动物模型．缺血2h后行再灌注，24h后经栓塞侧颈内动脉注入诱导后的MSCs（5×10^6/0．8ml）（n=61。2w后取脑组织行冰冻切片．通过检测人细胞核特异抗体MAB1281来鉴定移植的人MSCs。结果MSCs经阿魏酸钠诱导后．细胞逐渐圆缩并伸出突触．呈现神经细胞样形态。在移植大鼠脑内可检测到MAB1281呈阳性表达的人MSCs．且MSCs主要分布在缺血侧损伤灶的周围，明显高于对侧同部位及其它脑区。结论人MSCs源神经细胞移植后在大鼠脑内存活并主要聚集在脑内缺血灶的周围。     

真皮间充质干细胞生物学特性研究进展

1 前言 干细胞是具有高度增殖和自我更新能力,并可分化为多种不同靶细胞的细胞.在个体发育的过程中,干细胞经历了从全能干细胞(胚胎干细胞)到多能干细胞再到定向干细胞,最终分化为不同的成熟组织细胞的演变过程.近来,各个阶段干细胞的研究均取得了重要的进展.     

小鼠胚胎干细胞在胎肾微环境中共培养后表达肾标志物

胚胎干（ES）细胞是一种多潜能细胞具有分化成为来自三个胚层各种细胞甚至包括生殖细胞的能力。最新的研究表明，胚胎于细胞在与胚胎脏器细胞共培养后可以定向分化为多种特定细胞表型，他们包括肝细胞、心肌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞．并在某些情况下甚至可能形成成熟的器官组织结构。已有研究报道说明ES细胞通过在体外环境中直接形成拟胚体（EBs）可以分化成为肾细胞．并且最新的研究成果表明分离自这些EBs的细胞移植入体内后可以形成肾近端小管样结构并且未在其周同发现畸胎瘤形成。但是ES细胞是否可以通过和胎肾细胞相互作用继而获得定向分化并未见诸报道。在实验中我们发现．在与小鼠胎肾细胞共培养后．ES细胞分化成为了肾系细胞。处理后的ES细胞可以检测到与肾发育相关的特征基因．如WT-1、exm-2和Wnt-4基因的表达．我们也发现了终末分化的肾细胞标志物．如podocalyxin、Nephl和RSOR基因的表达。在实验前后，我们同样探寻了ES细胞多分化潜能标记分子的基因表达情况，结果显示共培养后分化的ES细胞Oct-4、Nanog和Klf-4基因表达明显减弱。综上，胎肾细胞微环境可能促使ES细胞定向分化为肾系细胞，提示胚胎器官细胞微环境在ES细胞转分化过程中可能扮演了重要作用。     

自体骨髓细胞移植对大鼠局灶性脑缺血区新生血管形成的作用

背景：骨髓细胞移植是一种简单而有效的促进新生血管生长的治疗手段。同样新生血管的形成和血液循环的再建立，对于脑缺血区域受损而未死亡神经元的修复以及为植入的组织与细胞的成活和分化提供必要的环境条件均具有重要意义。而自体骨髓细胞移植是否会促进脑缺血区新生血管的形成进行血运重建目前尚不清楚。目的：探讨经颈动脉移植自体骨髓细胞对脑缺血区新生血管形成的影响。设计：以实验动物为研究对象，随机对照的验证性研究。单位：一所大学医院的神经外科和泌尿外科研究所。材料：实验于2002-09／2003-04在江西医学院第二附属医院神经外科实验室，江西医学院泌尿外科研究所完成。选择雄性SD大鼠10只，体质量250～300g，清洁级。干预：复制局灶性脑缺血大鼠模型，经颈动脉注入自体骨髓细胞。动物随机分为实验组5只，经颈动脉注入自体骨髓细胞，对照组5只注入生理盐水。通过免疫组织化学染色方法进行微血管计数。观察脑缺血区血管增生状况。主要观察指标：微血管密度。F8因子免疫组化染色。结果：自体骨髓细胞移植后大鼠在皮质缺血区的微血管密度为(159．15&;#177;40．4)血管数／mm^2，明显较对照组大鼠(81．70&;#177;32．18)血管数／mm^2多，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。骨髓细胞移植组皮质缺血区可见很多散在的单个内皮细胞。而相应的脑缺血对照组少见散在的单个内皮细胞。结论：经颈动脉注入的自体骨髓细胞能够促进脑缺血区新生血管的形成。     

脂多糖诱导巨噬细胞产生诱导型一氧化氮合酶的实验研究

目的 观察脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对小鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(in-ducible nitric oxide svnthase,iNOS)的诱导作用.方法 常规方法获取小鼠腹腔巨噬细胞随机分成两组:空白对照组(培养基中不含LPS)及LPS组(分别含LPS 0.01,0.1.1.0,10mg/L的培养基培养24h).采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)和Western Blotting方法测定诱导型一氧化氮合酶的基因及蛋白表达水平.结果 RT-PCR和Westem Blotting结果表明,经0.1mg/L LPS刺激后细胞iNOS mRNA及蛋白表达水平均明显升高,与空白对照组比较有显著性差异(P&lt;0.05),并且在一定范围内呈剂量--效应关系.结论 LPS可诱导小鼠巨噬细胞产生诱导型一氧化氮合酶.     

缺血性脑损伤后MicroRNA 210及其靶基因ephrinA3的表达变化

Mir-210为缺氧特异性微小RNA(microRNA),缺氧环境下表达稳定上调~([1]);且有证据表明内皮细胞中过表达mir-210可下调其靶基因ephrinA3的蛋白表达,进而显著促进内皮细胞形成血管~([2]).我们通过构建大鼠急性脑缺血模型,观察脑缺血后各时间点缺血皮质区mir-210及其靶基因ephrinA3的表达变化,对其在脑缺血后血管新生过程中可能起到的调控作用进行了初步探讨.