动物细菌病的生物防制新策略

一、动物细菌性疾病生物防治的必要性 随着集约化养殖场的增多和规模不断扩大，环境污染越加严重，细菌性疫病明显增多，如鸡的大肠杆菌病、沙门氏菌病、葡萄球菌病、绿脓杆菌病、支原体病等。其中不少病的病原广泛存在于养殖环境中，可通过多种途径传播，这些环境性病原微生物，已成为养殖场的常在菌并引起常发病。     

传染性支气管炎病毒山东分离株S1基因的克隆及序列比较分析

参照Genbank中传染性支气管炎病毒（IBC）M41纤突蛋白S1的基因序列，设计一对引物，对山东地区IBV分离株RNA进行反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），成功扩增出约1634bp S1基因片段，将扩增出的S1基因分别克隆到T Easy质粒载体中，获得重组质粒，提取质粒DNA，利用Eco.RI酶切证实了重组质粒的特异性，并进行序列测序，克隆出的序列已被Gene Bank收录，序列号为：AY043313。将得到的序旬与标准株M41进行核酸序列和氨基酸同源性比较分析，与M41的核式酸同源率995。利用Omigo2.0软件对克隆出的山东IBV进行了理论酶切位点分析，在BstYI、AluI和BgⅢ位点与M41不同，结合血清学和分子生物学实验结果推测：山东A分离株可能是M41的变异株。     

丹参水提物对山羊子宫内膜上皮细胞炎症模型中基质金属蛋白酶-2表达的影响

为研究丹参水提物(SME)对子宫内膜上皮细胞炎症模型中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响,体外培养山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),利用内毒素(脂多糖,LPS)诱导细胞增殖和产生TNF-α,建立EEC炎症模型。然后给予高、中、低不同剂量SME干预。应用MTT比色法检测细胞活力,ELISA试剂盒检测TNF-α含量,实时荧光定量PCR检测细胞MMP-2mRNA表达变化。结果表明,5μg/mL LPS作用EEC 12h时促增殖作用显著(P0.01);SME可显著促进EEC炎症模型中MMP-2的表达,以中、高浓度组的作用较为明显。说明SME对LPS引起的子宫内膜炎症反应有一定的保护作用。     

哈长城市群生态系统服务时空特征及其权衡/协同关系研究

哈长城市群位列国家二级城市群之首,研究哈长城市群地区的生态系统服务变化及权衡协同关系对促进该区域可持续发展具有深远意义。基于多源遥感数据结合InVEST模型及权衡协同度模型(ESTD),分析了哈长城市群2000年、2010年、2015年土地覆被变化;评估了土壤保持、生态系统碳储量及产水量3种生态系统服务的时空分布及其权衡协同关系。结果表明:(1)2000-2015年,哈长城市群内建设用地共增加1462 km²,其中,2000-2010年增长量(958 km²)高于2010-2015年(504 km²),15年间林地共增加1527 km²,草地、耕地及裸地分别减少661 km²,1611 km²,780 km²;(2)15年间土壤保持量持续降低,生态系统碳储量先减后增,产水量先增后减;(3)6种土地覆被类型中,单位面积下林地提供的土壤保持力最高,湿地提供的生态系统碳储量和产水量最高;(4)协同作用在哈长城市群3种生态系统服务间占主导地位;南部的土壤保持-生态系统碳储量及土壤保持-产水量多为协同关系,北部相反,从全区来看生态系统碳储量-产水量间的相关关系相对较弱。研究结果可为哈长城市群地区制定更为全面具体的生态保护策略提供参考依据。     

细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究

试验旨在对细毛羊毛囊干细胞的分离培养方法进行初步研究,建立细毛羊毛囊干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法、机械分离法和两步酶消化法+机械分离法3种方法分离培养细毛羊毛囊干细胞,通过测定毛囊干细胞的数量、克隆形成率及毛囊干细胞的增殖能力等综合评估3种培养方法的优劣,寻求既能方便获得大量毛囊干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。倒置显微镜下观察3种培养方法获得的细胞均为铺路石状,均表达角蛋白K19和整合素β1,表明成功获得细毛羊毛囊干细胞,建立体外培养体系。采用"两步酶消化法和机械分离法"相结合的方法获得毛囊干细胞体外培养效果最优。     

荷斯坦奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养

为建立和完善奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养技术,采用组织培养和胶原酶消化相结合的方法,对中国荷斯坦奶牛的子宫内膜上皮细胞进行了原代分离培养,经胰酶差时消化进行纯化,并以免疫组化法检测角蛋白表达。结果显示,所采用的方法可高效获得呈铺路石样的上皮细胞,角蛋白表达呈阳性,第2~8代的传代细胞在形态特征和增殖状态上保持着与原代细胞相近的生物学特征。     

Ⅰa型牛源无乳链球菌M7菌株Sip基因的分子特征分析

通过PCR方法扩增Ⅰa型牛源无乳链球菌地方菌株M7的Sip基因,将目的片段克隆入pGEM-T Easy载体并进行测序,采用多种生物软件对Sip基因及其表达的蛋白质进行分子特征分析。试验结果表明,M7菌株的Sip基因为1305 bp,未出现基因缺失;与GenBank中发表的不同血清型的无乳链球菌菌株的相应核苷酸序列同源性为98.0%~100.0%,推导的氨基酸同源性为97.2%~99.8%。M7的Sip基因与中国菌株Ly2(FJ808732)和美国菌株GB00549(FJ752159)的相应基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性均为100.0%,氨基酸同源性均为99.8%。该Sip基因表达的蛋白质是一种稳定的分泌性外膜蛋白,疏水性强;其N-末端的第52-95位氨基酸残基之间含有1个LysM超家族的保守结构域;存在1-25位氨基酸的信号肽,剪切位点在第25-26位氨基酸之间;存在多个B细胞和T细胞表位。说明M7菌株的Sip基因是未缺失LysM超家族结构域的比较保守的免疫蛋白。     

黄藤素对山羊子宫内膜上皮细胞的体外毒性研究

为了探究黄藤素的体外细胞毒性,采用不同浓度的黄藤素作用山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）后,采用MTT法绘制细胞生长曲线;倒置显微镜下观察细胞生长状态;瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态学变化并通过测定乳酸脱氢酶（LDH）含量检测细胞膜的完整性。结果显示,当黄藤素的浓度为10~227 μg/mL时,黄藤素对EECs有促增殖的作用;当浓度大于227 μg/mL时出现细胞增殖抑制现象,药物对细胞的半数增殖抑制率（IC₅₀）为360 μg/mL;瑞氏-姬姆萨染色结果显示,100、200 μg/mL的黄藤素作用于EECs时均未对其细胞核、细胞浆的形态产生影响;LDH结果显示,药物浓度≥250 μg/mL时细胞LDH的释放量极显著高于正常细胞组（P<0.01）。综上所述,黄藤素作用于山羊EECs后呈现一定的毒性作用,且呈现显著的剂量依赖效应,作用于EECs的安全剂量范围为≤250 μg/mL。     

基于GC-MS技术的蹄叶炎奶牛血浆代谢谱分析

【目的】利用气相色谱/质谱联用技术(gas chromatograph tandem mass spectrometer technology,GC-MS)对奶牛血浆进行代谢组学分析,以明确奶牛发生蹄叶炎时血浆中代谢物的变化,进一步揭示其发病机制。【方法】根据蹄叶炎奶牛的临床症状和活动量情况,选取蹄叶炎患病组S和健康对照组C奶牛各10头,采集血浆样品,经衍生化处理后,利用GC-MS方法对两组奶牛的血浆进行全部代谢物检测。用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法分析(supervised partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA),对蹄叶炎组奶牛和健康组奶牛检测数据进行模式识别分析,筛选差异代谢物,并利用生物信息学方法进行代谢通路富集分析。为进一步验证代谢组学的试验结果,检测了与差异代谢通路相关的脂质代谢指标和抗氧化能力指标。【结果】利用GC-MS方法,在奶牛血浆中共检测到242种代谢物,通过多元统计分析结合t-检验筛选出37种差异代谢物(VIP1,P0.05),其中在蹄叶炎奶牛血浆中3种物质含量上调(FC1),分别是氨基氧乙酸、油酸、乳糖,34种物质含量下调(FC1),包括脂肪酸、氨基酸等。经代谢通路富集分析,发现变化显著(P0.05)的代谢通路包括脂肪酸生物合成通路,甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路,不饱和脂肪酸生物合成通路,嘌呤代谢通路,甲烷代谢通路,苯丙氨酸代谢通路和氰基氨基酸代谢通路。在验证试验中,发现两组奶牛血浆中脂质代谢相关指标差异显著,且蹄叶炎患病牛血浆抗氧化能力显著低于健康牛,与代谢组学结果一致。【结论】利用GC-MS技术分析了蹄叶炎患病牛与健康奶牛血浆代谢谱的变化,发现两组间代谢物存在显著差异,并筛选出了37种差异代谢物,而这些差异分子可能成为奶牛蹄叶炎早期诊断或群体监测的潜在生物标记物。本结果全面揭示了奶牛蹄叶炎发生后血浆代谢物的代谢规律,为进一步阐明其发病机制提供理论依据。     

奶牛子宫内膜炎的预防和治疗

奶牛子宫内膜炎是子宫黏膜的粘液性或化脓性炎症。是奶牛最常见的产科病之一,是引起奶牛不孕的主要原因。据报道,每年美国因奶牛不孕症造成的经济损失近2．5亿美元;英国报道不孕牛中约95％是由于子宫内膜炎引起。瞿自明等1983-1985年对北京、上海、南宁、兰州等16个城市41个奶牛场调查了9754头适龄奶牛,