替加环素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药株16SrRNA基因突变位点分析

目的体外诱导替加环素耐药金黄色葡萄球菌的核糖体16Sr RNA基因位点变异研究。方法收集4株替加环素均敏感的金黄色葡萄球菌,分别编号为S2、S3、MS2和N315,通过体外不同浓度梯度多步诱导替加环素耐药;挑取单克隆,经BD公司viet自动药敏分析仪分析常规药敏特点;用E-test条测定母株和诱导菌株替加环素MIC值,并用琼脂平板稀释法测定诱导系列Omacycline和Eravacycline的MIC值;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增金黄色葡萄球菌5个拷贝的16Sr RNA基因,扩增产物经测序后与野生株比较获得突变位点。结果经体外多步法诱导替加环素耐药的不同MIC值的金黄色葡萄球菌共8株。PCR测序分析4株母株均无变异位点,16Sr RNA的突变位点主要是C1036T、G848C,此外还有T1043C、T1125C、T1038G、A1053G、T1283C、C1042T、C1047T、G1035A、C817G、G1107C、G697T、C819G。结论体外多步法可诱导金黄色葡萄球菌替加环素耐药,耐药机制可能与16Sr RNA位点发生C1036T和G848C突变相关,但仍需进一步研究证实突变位点与耐药的关系。     

2例利奈唑胺中介粪肠球菌血流感染的毒力及耐药机制

目的对血流感染患者临床分离的利奈唑胺中介粪肠球菌的毒力因子及耐药机制进行初步研究。方法从2例血流感染患者血标本中分离2株利奈唑胺中介粪肠球菌,分析患者治疗经过,2株分离菌编号为A、B,测定其对利奈唑胺和万古霉素的最低抑菌浓度(MIC),采用聚合酶链反应(PCR)扩增毒力基因(esp、asa1、gelE、ace、agg、efaA、cylA、hyl)和利奈唑胺耐药相关基因,包括23SrRNA V区基因、cfr、cfr(B)及optrA基因片段,其中23SrRNA V区基因扩增产物送测序并分析有无突变位点。结果 2例患者培养出利奈唑胺中介粪肠球菌后均使用利奈唑胺治疗控制了临床症状。菌株A、B对万古霉素、替考拉宁、氨苄西林、呋喃妥因敏感,对利奈唑胺中介(MIC均为4μg/mL),对万古霉素敏感(MIC分别为1μg/mL和4μg/mL)。2株菌均含有多种毒力因子,菌株A仅cylA、hyl为阴性,菌株B仅hyl、esp为阴性,其余毒力基因均为阳性。菌株A的23SrRNA V区存在G2621T突变,菌株B未发现突变位点。菌株A和B耐药基因cfr、cfr(B)、optrA均为阴性。结论此研究中血流感染患者分离的利奈唑胺中介粪肠球菌对万古霉素和氨苄西林敏感,虽治疗结果提示利奈唑胺仍有效,但临床中选用利奈唑胺治疗需谨慎。靶位突变是该类药物重要的耐药机制,临床中治疗该类药物不敏感粪肠球菌感染需足够重视,其治疗策略仍需进一步探讨。     

E645R变异MXA蛋白抗HBV复制体外研究

目的研究E645R变异MXA蛋白抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制活性。方法对pcDNA3.1-MXA重组质粒采用定点突变构建E645R变异MXA蛋白表达重组质粒pcDNA3.1-MXA-E645R。将pcDNA3.1-MXA(MXA组),pcDNA3.1-MXA-E645R(E645R组)和pcDNA3.1空质粒(对照组)分别与PU19-1.24HBV重组质粒按2∶1比例瞬时共转染HepG2细胞,转染3d后检测MXA蛋白表达和各组细胞上清HBsAg和HBeAg的量以及上清和细胞内HBVDNA水平。结果酶切和测序表明定点突变成功构建pcDNA3.1-MXA-E645R重组质粒;MXA、E645R转染组有较好的MXA蛋白表达。E645R组与MXA组HBsAg较对照组分别下降23%和20%(P>0.05),E645R组和MXA组HBeAg较对照组分别下降61%和66%(P<0.05)。E645R组与MXA组上清HBVDNA水平较对照组分别下降1.9个和2.2个log值,细胞内HBVDNA水平均下降1.7个log值。结论E645R变异MXA蛋白具有较好的抗HBV活性,E645R变异不影响MXA蛋白抑制HBV复制。     

代谢相关脂肪性肝病患者血维生素特征及疾病严重程度相关性分析

目的 探索代谢相关脂肪性肝病(metabolic-related fatty liver disease, MAFLD)患者血维生素A、B2、B6、B12、D、E、K1、K2和叶酸的代谢异常特征及其与MAFLD严重程度的相关性。方法 2022年9月—12月,通过社区MAFLD筛查活动募集473名居民。通过问卷调查、体格检查获取居民健康信息;通过肝脏瞬时弹性成像进行脂肪肝检测;通过液相色谱串联质谱法检测血维生素浓度。采用两独立样本t检验评估组间差异,单因素卡方检验和多因素Logistic回归分析探讨MAFLD的相关因素。结果 符合MAFLD诊断标准的有195例(41.23%, 195/473),轻度脂肪肝有43例(22.05%, 43/195),中度脂肪肝有88例(45.13%, 88/195),重度脂肪肝有64例(32.82%, 64/195)。以同一时期收集到的健康居民血维生素为对照,MAFLD患者的外周血维生素A、E、K1和K2水平均要高于健康居民组,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着脂肪肝的严重程度增加,血维生素A、E、K1和K2浓度升高[R=0.149,P=0.0...     

利奈唑胺诱导粪肠球菌耐药50S核糖体蛋白突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体蛋白位点变异特征。方法收集1株血流感染的粪肠球菌利奈唑胺敏感株,通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增核糖体蛋白L3和L4(对应rpl C和rpl D基因),扩增产物经测序后与野生株比较,获得核糖体蛋白及对应氨基酸的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株。PCR测序分析2株母株均无变异位点,rpl C基因对应的氨基酸位点不尽相同,rpl D基因普遍存在T301C位点变异,对应的氨基酸为Phe101Leu。结论体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与核糖体蛋白位点突变密切相关,但仍需进一步研究证实突变位点与耐药的关系。     

2株利奈唑胺中介粪肠球菌23S rRNA V区基因变异检测

目的研究粪肠球菌对利奈唑胺（LNZ）的耐药情况和耐药机制,为临床合理用药提供依据。 方法收集2012年1月-2013年1月深圳市南山区人民医院接受LNZ治疗患者痰液标本分离的粪肠球菌12株,采用琼脂稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),聚合酶链反应（PCR）扩增23S rRNA V区基因,并进行测序分析。结果12株菌中,2株为中介株（菌株编号分别为3和6）,10株为敏感株。2株中介株均检测到G2576U突变,其中1株（编号6）还同时存在C2424U突变;10株敏感株未检测到变异。C2424U和G2576U突变分别发生在23S rRNA V区基因的R1区和R4区。结论粪肠球菌LNZ中介株中发现23S rRNA V区基因变异,提示临床应密切关注LNZ的MIC变化。     

抗血小板衍生生长因子小干扰RNA表达质粒构建及其对肝星状细胞的影响

目的 研究靶向PDGF-B链的小干扰RNA(siRNA)对肝星状细胞(HSCs)细胞外基质分泌的影响.方法 根据PDGF-B链序列设计合成siRNA序列,将siRNA序列插入pSilencer 3.1-H1hygro质粒,酶切后测序鉴定;PDGF-B链siRNA表达质粒转染HSCs,潮霉素筛选阳性细胞株,RT-PCR和Western blot分别检测PDGF Mrna和蛋白的表达;将各组筛选的阳性HSCs细胞株培养,MTT观察各组细胞增殖,放射免疫法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达. 结果 成功构建3种表达PDGF-B链siRNA表达质粒,RT-PCR和Western blot结果表明各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF Mrna和蛋白表达均有明显抑制.PDGF-B链siRNA表达质粒HSCs细胞组较对照组能明显降低HSCs增殖,下调透明质酸和Ⅲ型前胶原表达.结论 靶向PDGF-B链的siRNA能降低HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力,具有抗纤维化治疗的潜力.     

卡泊芬净对粪肠球菌生物膜形成能力影响的初步研究

目的分析卡泊芬净抑制粪肠球菌生物膜形成的情况。方法选取临床来源生物膜强阳性粪肠球菌1株及不同生物膜形成能力的粪肠球菌菌株10株,同时设卡泊芬净干预组和对照组,干预组加卡泊芬净,浓度为20μmol/L,对照组加生理盐水。采用结晶紫染色法,通过酶标仪检测两组粪肠球菌浮游菌生长及生物膜形成情况。结果卡泊芬净对粪肠球菌临床株的浮游菌生长无抑制作用,可显著抑制菌株生物膜形成。结论卡泊芬净对粪肠球菌生物膜形成能力有显著抑制作用。     

肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究

目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。