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目的探索甲硫腺苷磷酸化酶(Methyhhioadenosine Phosphorylase,MTAP)在人支气管上皮BEP2D永生化细胞的恶性转化过程和临床非小细胞肺癌中的表达变化。方法培养BEP2D和BERP35T-2细胞,制备细胞总蛋白,进行双相电泳和质谱分析;选择有表达差异的蛋白质点MTAP,在细胞模型中进行NorthernBlot分析;对获得的15例肺癌标本用RT—PGR方法分析验证MTAP的表达水平。结果双相电泳发现MTAP在恶性转化细胞BERP35T-2中表达降低;Northern Blot分析表明MTAP mRNA在BEP2D永生化细胞中表达水平很高,而在BERP35T-2恶转细胞中表达极低;对15例非小细胞肺癌进行RT-PCR分析,发现MTAP在73.3%(11/15)的肿瘤组织中低表达;在中/低分化组肺癌的低表达频率(90.9%)显著高于高分化组(25%),在腺癌与鳞癌组则没有显著性差异。结论MTAP低表达现象与肺癌恶性转化密切相关,可能发挥抑癌基因的生物学功能。 相似文献
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目的从基因组水平探讨BEP2D辐射致癌模型中MTAP基因表达降低的原因。方法培养和传代BEP2D和BERP35T-2细胞,提取基因组DNA;设计针对MTAP基因8个外显子的引物,PCR扩增方式观察MTAP有无纯合性缺失,并对PCR产物进行SSCP分析;选择9p21.3区的三个STS位点,PCR扩增分析该区域杂合性缺失的状况;设计针对MTAP基因CpG岛的MSP(Methvlation—specified PCR甲基化特异性)引物,对基因组DNA进行硫化处理和纯化,PCR扩增以研究MTAP基因区域的杂合性缺失现象。结果在细胞中MTAP基因没有发生纯合性缺失和点突变,启动子区域亦没有甲基化调节现象;BERP35T2细胞有杂合型缺失(Loss of Hetemdeletion,LOH)现象,发生位置在RH99034。结论在致癌模型中MTAP基因的表达降低或丧失是因为MTAP所在的基因组区域发生了杂合性缺失,提示9p21.3区域的杂合性缺失可能是肺癌中发生的高频率事件。 相似文献
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两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究 总被引:5,自引:0,他引:5
我们比较了结核分枝杆菌 (结核菌 )基因组DNA及其聚合酶链反应 (PCR)产物的灵敏度与特异性 ,并对结核病人痰标本进行了检测。一、材料和方法1 菌种来源 :2 4种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所 ,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。2 标本收集 :90份痰标本来自本院结核科住院病人 ,经X线检查、临床表现确诊。 30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。3 标本DNA提取 :采用本室研制的标本前处理试剂盒。4 引物 :引物a :根据文献 [1]报道设计。扩增产物为35 0bp ,5′ GAA… 相似文献
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目的 通过基因工程的方法获得风疹病毒E1蛋白在原核系统内可溶性表达,亲和纯化后,评价该重组蛋白在风疹病毒患者血清学诊断方面的可行性.方法 将PCR扩增得到的风疹病毒E1核酸序列克隆至原核表达载体pET-NusA中,利用原核系统表达融合蛋白NusA-E1,用Western Blot和ELISA方法对其抗原性进行初步评价.结果 NusA-E1蛋白以可溶性形式进行表达,亲和纯化后可以获得高纯度的重组蛋白.Western Blot和ELISA方法结果均证明该重组蛋白具有较强的抗原活性.结论 融合蛋白NusA-E1在大肠埃希菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白NusA-E1抗原性强,临床上可以作为血清学诊断抗原,检测风疹病毒抗体. 相似文献
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目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75%;健康人血清检出1例,检出率为1.7%,特异度为98%;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3% (59/60),阴性检出率100%,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体. 相似文献
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目的 研究人支气管上皮细胞恶性转化过程中 ,TGF β1表达水平的变化及其对细胞生长、增殖的影响 ,为进一步研究辐射诱发肿瘤发生的机理奠定基础。方法 在 2 4孔板中按 5× 10 4细胞 /孔分别接种对数生长期的BEP2D及BERP35T 2细胞 ,用一定浓度的TGF β1处理 ,计数 ,绘制细胞生长曲线 ,同时于光镜下观察细胞形态及生长状况。用westernblot方法检测胞浆内及分泌到培养液中的TGF - β1的丰度。 结果 两种细胞胞浆内的TGF β1表达水平无明显差异 ,但BERP35T 2细胞分泌到培养液中的TGF β1丰度约为BEP2D细胞的 5倍。TGF β1对两种细胞的生长均有抑制作用。在相同的浓度下 ,TGF β1对BERP35T 2细胞的生长抑制作用较BEP2D细胞弱。 结论 在辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中TGF β1对其生长抑制作用减弱。 相似文献
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目的研究甲硫腺苷磷酸化酶(Methyhhioadenosine Phosphoylase,MTAP)在人支气管上皮细胞(BEP2D)辐射致癌恶性转化前后的表达水平变化。方法培养永生化细胞BEP2D和恶性转化细胞BERP35T-2;制备细胞总蛋白质,进行双相电泳和质谱分析;选择有表达差异的蛋白质点MTAP,在细胞模型中进行Northern Blot和Western blot分析。结果双相电泳发现MTAP在恶性转化细胞BERP35T-2中基本没有表达;Northern Blot和Western Blot分析表明MTAP基因在BEP2D永生化细胞中转录和翻译表达水平均很高,而任BERP35T-2恶转细胞中表达极低;发现MTAP基因在两种细胞中的表达差别在10倍以上。结论MTAP的低表达与辐射致肺癌的发生有密切关系,是BEP2D受到α粒子辐射后基因表达谱的主要改变之一。 相似文献
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甲硫腺苷磷酸化酶 ( 5’ MethylthioadenoninePhosphorylase ,MTAP) ,EC∶2 4.2 .2 8,最初缩写为MSAP或MTAPase ,是嘌呤和甲硫氨酸合成补救途径中一个关键的酶[1] ,属于嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)家庭 2的成员之一 ,其活性形式是同源三聚体 ,有碱基、甲硫核糖和巯基 /磷酸结合位点。MTAP在正常细胞和组织中表达很丰富 ,但在人或鼠来源的多种恶性细胞系和人类多种肿瘤如乳腺癌[2 ] 、白血病[3 ] 、骨肉瘤[4] 、口腔癌[5] 、子宫癌[6] 和肺癌[7] 等中有较高频率的纯合性缺失现象。利用MTAP在多种肿瘤中表达缺失的特点 ,通过甲硫氨酸饥… 相似文献
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目的:从结核分枝杆菌基因组克隆Rv3881c基因并重组入pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达。重组蛋白经纯化后通过Western blot分析初步鉴定其抗原性和特异性。方法:提取H37Rv标准株的基因组DNA。以基因组DNA为模板PCR扩增出Rv3881c基因,连接到pGEMT上。经过筛选鉴定后。将重组子测序;将测序正确的基因双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-48;在BL21菌株中优化表达并采用金属鏊合层析方法纯化蛋白:选取6例结核病阳性临床血清标本和6例健康人血清标本进行Western blot分析。结果:发现从保存的H37Rv菌株克隆得到了读码框完全正确的Rv3881c基因。它在大肠杆菌中可以高效表达。表达量约占细菌总蛋白的20%以上。重组蛋白不与健康人血清反应。可与结核标本血清有较强的免疫印迹反应。结论:重组Rv3881c具有较好的特异性。该抗原有潜力成为检测结核的有效抗原组分之一。 相似文献