检验检疫生物安全分子标准样品的研制与应用

伴随着国际贸易的迅猛发展,传染性和检疫性有害生物给世界各国的生物安全带来极大威胁。本文从检验检疫生物安全分子标准样品的主要类别和种类,生物安全管理要求与工作需求,分子标准样品的关键制备技术问题,我国分子标准样品研发状况,以及应用领域和应用前景等几个方面进行综述。     

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。     

NDM-1基因PCR检测技术的研究

NDM-1基因是一种"超级细菌"特有的耐药基因,对于菌体的广谱抗药性起着决定性的作用。本研究以实现该基因的快速检测为目的,初步建立了NDM-1基因的PCR快速检测鉴定法。选取肺炎克雷伯氏菌ADB65的NDM-1基因为目的基因,设计并合成了PCR检测引物(ND-319-F和ND-319-R),并以另外11种标准菌株为对照,分别进行了PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA经过PCR反应都扩增出长为319bp的特异性片段,而其他对照病菌均未出现相应片段,证明这对引物具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出100fg/μL质粒DNA模板。研究表明,PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

荧光检测食品法标准数据库的建立

目的荧光检测是食品安全标准体系中的常用分析方法,为简化日常检验、标准研发中的工作流程,建立荧光检测食品标准数据库。方法对我国现行标准体系中,采用荧光方法的标准进行系统梳理、整合及本地存储,通过C#开发语言、Framework NET 4.2以及Visual Studio 2010开发平台进行了数据库的搭建。结果建成了中国荧光检测食品标准数据库,迄今收集到303条相关物质的信息,随着标准体系发展以上内容将同步更新。结论该数据库可为一线检验人员以及标准研发人员提供快速、一站式的荧光检测分析信息服务。     

荧光法在食品理化检验标准中的应用进展

近年来,荧光检测法以其灵敏度高、特异性强、易于操作及定量精准等优点,在食品理化检验领域获得了越来越多的应用,其相应的检验标准,包括国家标准、农业部标准、检验检疫行业标准、农业部公告、地方标准等也日渐增多,其更新修订的频率与数量也逐年递增。本文对我国现行有效的理化标准中所采用的荧光检测方法,包括荧光分光光度法、薄层色谱-荧光法、高效液相色谱-荧光法、原子荧光法等进行了总结,并着重对液相色谱荧光法中的目标物提取、免疫亲和净化、分离检测条件等进行了论述,最后对荧光检测的当前热点以及未来发展趋势进行了展望。本文为相关科研人员在荧光检测领域的标准起草、草案建议、方法开发及日常食品安全分析检验提供了有力的技术支持。     

重组酶等温扩增技术快速检测对虾中的白斑综合征病毒

摘 要: 目的 针对对虾中白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV),分别建立基于国外专利技术的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)方法,基于国内专利技术的重组酶介导等温扩增法(Recombinase-aided amplification, RAA) 方法,并对两种方法进行比较。方法 应用重组酶等温扩增技术在恒温(39℃)条件下完成扩增反应的优势, 调整反应体系中模板DNA和探针浓度, 优化WSSV病毒RPA和RAA两种方法的反应体系, 建立了可靠稳定的等温扩增RPA和RAA快速检测方法,比较了两种方法的特异性、灵敏度、扩增效率和稳定性。。结果 所建立的荧光RPA和RAA方法在恒温39 ℃的条件下特异性检测WSSV, 检测构建质粒DNA的灵敏度可达到1.0×106 copies/μL, 检测实际感染阳性样品的灵敏度可达到1.31×101 pg/μL; RPA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9970, 扩增效率为 98.50%;RAA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9910, 扩增效率为 98.50%。 结论 所建立的基于重组酶等温扩增技术的RPA和RAA方法,特异性好,对于质粒和阳性样品检测灵敏度一致,扩增效率一致,具有很好稳定性。适用于水产品养殖及生产加工和通关口岸进口虾类产品中WSSV病毒的现场快速筛查防控。     

扇贝和利玛原甲藻混合基体中大田软海绵酸和鳍藻毒素-1标准样品的研制

目的 研制基于扇贝和利玛原甲藻混合基质的大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1）定量分析标准样品。方法 以扇贝组织和含有OA和DTX1的利玛原甲藻的藻泥为原料，经充分混匀、冷冻干燥制备基体OA和DTX1标准样品，开展定性确证以及均匀性、稳定性检验和协同定值分析。结果 经确证该标准样品中含有OA和DTX1；经方差分析法（F检验）检验评价均匀性良好；考察长期稳定性和模拟运输条件下短期稳定性，样品性能稳定；该基体标准样品中OA和DTX1特性标准值及不确定度分别为（7.039±0.272） mg/kg （k=2）、（2.012±0.021） mg/kg（k=2）。结论 该混合基体标准样品填补了国内目前没有该类标准样品的空白，可以用于方法验证、检测过程质量控制、能力验证等实验室质量控制活动。     

沙门氏菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立

建立利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对食品中沙门氏菌的快速检测方法.从食品中分离出可疑沙门氏菌,利用不同培养基分离纯化,通过MAIDI-TDF-MS法进行鉴定,并与其他检测方法比较.MALDI-TOF-MS对野生沙门氏菌株的鉴定结果与传统鉴定结果一致,说明本试验建立的方法对于沙门氏菌的鉴...     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

高效液相色谱法检测饮料中7种人工合成色素

目的建立饮料中7种人工合成色素柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红的高效液相色谱法检测方法。方法样品中的7种人工合成色素在pH=6的条件下经1.0%的乙腈水提取,超声,离心后供液相色谱检测。检测波长为420、520、650 nm,外标法定量。结果 7种人工合成色素在1.0~50μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9981,平均回收率为73.6%~107.2%,RSD为7.65%~14.77%,检出限均为5 mg/kg。结论本方法操作简便、经济实用、结果准确可靠,可用于样品的批量检测。