番木瓜eIF4E和eIFiso4E酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

通过RT-PCR获得番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的编码区,将其分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-eIF4E,pBD-GAL4-eIFiso4E。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的番木瓜eIF4E,eIFiso4E基因编码区,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,在SD/-His-Trp营养缺陷平板上不能生长,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,这为下一步利用酵母双杂交系统检测番木瓜eIF4E,eIFiso4E蛋白与病毒的相互作用奠定了基础。     

番木瓜eIF(iso)4E基因克隆及其结构和表达分析

 eIF4E ( eukaryotic translation initiation factor 4E) 家族基因在多种病毒侵染植物过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE方法在番木瓜中克隆了cDNA全长为995 bp的eIF4E异构体基因, 命名为CP-eIF(iso)4E(GenBank登录号为FJ595992) 。其编码的蛋白含有206个氨基酸, 蛋白一级结构中的活性部位位点高度保守, 三维结构中可能的抗性位点位于帽结合区域( cap-binding pocket) 表面。半定量RT-PCR结果表明, CP-eIF ( iso) 4E在番木瓜叶片中表达较弱, 在花瓣中表达最强。     

P型PRSV-VPg蛋白与寄主eIF4E蛋白的互作

为研究番木瓜环斑病毒P型株系(PRSV-P)的病毒基因组连接蛋白(VPg)与寄主eIF4E蛋白的互作,采用双分子荧光互补技术(BiFc),通过基因枪转化法轰击洋葱表皮,在荧光显微镜下观察两者间的互作结果.结果表明:番木瓜eIF4E与P型PRSV-VPg,西瓜eIF4E与P型PRSV-VPg蛋白均发生互作.eIF4E与VPg的互作为研究通过转基因方法抑制或过量表达突变关键位点的寄主因子,阻断关键因子互作获得抗病植株提供了可行性依据.     

猴面花miRNA及靶基因的生物信息学预测

以猴面花基因组序列为试材,通过psRobot网站进行茎环结构预测,应用blast-2.2.27+软件与rfam数据库和pfam数据库比对后去除非miRNA序列,应用bioedit分析miRNA序列及前体序列的碱基组成特点。结果表明:猴面花基因组中共发现105条成熟miRNA序列,分别属于49个不同miRNA家族;miRNA序列和其侧翼序列都存在碱基偏倚现象,miRNA5′端第1碱基和第19碱基尿嘧啶和胞嘧啶出现的频率分别为67.6%和49.5%;93个miRNA预测到了靶基因,其中有64个靶向转录因子。     

我国番木瓜抗环斑病毒种质资源创新研究及应用

针对我国具有自主知识产权的番木瓜环斑病毒抗病资源匮乏,制约我国番木瓜育种产业发展的关键问题及现有育种发展研究基础,指出利用现代生物技术开展番木瓜种质资源创新研究是我国番木瓜创新育种的必由之路,为我国番木瓜育种产业的健康和可持续发展提供理论依据。     

PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达及其在番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系中诱导RNA沉默的研究

为探索利用PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达产物在体外防治番木瓜环斑病毒的可行性,利用较保守的PRSV-NIb基因3’端的312、501和809 bp区段分别构建了含有PDK内含子的3个发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jml09LacY分别作为宿主载体和宿主菌构建了高效的dsRNA原核表达工程菌M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N312、M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N501、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N809,经IPTG诱导成功表达了dsRNA,并证明dsRNA不被DNase I和RNase A降解,稳定性较好.还利用PRSV-NIb基因构建了GFP瞬时植物融合表达载体pNIb-GFP,对经3种dsRNA和GFP瞬时融合表达载体共转化的番木瓜叶片原生质体的共聚焦显微镜观察及通过半定量RT-PCR对其中mRNA表达量的分析,结果表明融合基因NIb-GFP的表达均发生了不同程度的下调,说明dsRNA在原生质体中引发了针对同源基因的沉默.     

利用ID-ELISA技术调查分析海南3种主要番木瓜病毒分布及感病情况

利用PCR方法分别扩增番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）、番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）和番木瓜花叶病（papaya mosaic virus,PaMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因,并连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP,通过转化、诱导表达后,经SDS-PAGE分析显示,这3种CP蛋白在大肠杆菌中高效表达,其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵体形式存在,PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得了3种病毒的重组CP蛋白,并免疫大白兔获得高效价的抗体。Western blot检测结果表明,这3种抗血清与对应的诱导表达蛋白发生特异反应。再采用抗血清建立一种快捷、简便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技术,并利用此技术对海南岛283个疑似感病的番木瓜样品进行检测鉴别,初步掌握了海南岛3种主要番木瓜病毒的分布及感病情况,为下一步该病的有效防治策略提供科学依据。     

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。     

番木瓜eIF4E突变基因的构建

真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor4E,eIF4E）的缺失或突变能影响病毒对植物的侵染,并介导植物对病毒产生抗性。已有研究证明,番木瓜环班病毒的VPg能与番木瓜elF4E（Cp－eIF4E）互作,在此基础上,笔者通过蛋白序列比对和同源建模分析,确定了6个突变位点,采用套叠PCR方法印Cp－eIF4E基因进行点突变,然后,将它们分别连接到酵母双杂交系统和双分子荧光互补系统两套表达载体上,为后续互作实验和抗病功能验证奠定基础。     

番木瓜畸形花叶病毒hc-pro基因保守基序FRNK点突变对病症表现的影响

为研究番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）hc-pro基因保守基序FRNK对病症表现的影响,本研究采用定点突变的方法,获得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）的突变体克隆p35SPLDMV-GFP-R183/I,该位点突变显著减轻了PLDMV在番木瓜上的病症表现,表明是影响其致病性的关键位点。本研究结果为利用交叉保护防控番木瓜畸形花叶病毒病提供了重要参考和材料。