一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

侵染性克隆是研究病毒的重要工具,而偏大的病毒基因组及其在大肠杆菌中的不稳定给构建侵染性克隆造成很大困难。通常采用插入内含子和酵母同源重组等方式可以获得稳定克隆,但本实验最初利用酵母同源重组系统并未成功构建番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的侵染性克隆。经研究证实,该不稳定现象确实存在于大肠杆菌中,而非酵母和农杆菌细胞。通过改良酵母同源重组方法,成功构建了有/无内含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2,农杆菌注射接种番木瓜均发病,侵染效率达64.7%~69.7%。本研究通过酵母同源重组质粒直接转化农杆菌,建立了一种10 d内即可稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的E.coli-Free酵母同源重组新方法。该方法对其他在大肠杆菌中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建具有重要意义。     

番木瓜中6个BG生物合成相关基因荧光定量分析

异硫氰酸苄酯（benzyl isothiocyanate,BITC）是医学界公认的具有防癌抗癌活性的成分,对多种癌症具有很好的作用。BG是BITC的前体物质,可以在芥子酶的作用下水解生成BITC。研究表明,BG在热带水果番木瓜中含量丰富。本研究在克隆了番木瓜中6个相关基因和测定了BG在番木瓜不同组织中含量的基础上,采用实时荧光定量PCR技术,对6个基因在番木瓜不同组织中的表达量进行测定,并与BG的含量进行比较,考察其相关性。结果表明各基因的表达量相对较高时BG的含量也较高,即6个基因在番木瓜中的表达量与BG的含量存在相关性。我们推测,这6个基因可能是番木瓜中BG生物合成相关基因。本文结果为进一步研究基因的功能提供了理论依据。     

PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。     

响应面法优化微波辅助提取山茶籽油的工艺研究

依据响应面法原理,使用SAS软件的中心组合设计建立提取数学模型,对微波辅助提取山茶籽油的液料比、微波功率、提取时间和提取温度进行优化组合.确定最优操作工艺参数为:时间45 min,功率244 W,温度40℃,液料比7∶1.在该工艺条件下,山茶籽油得率为38.47％.GC-MS定性定量分析山茶籽油中不饱和脂肪酸含量,其中油酸和亚油酸的含量分别为63.32％和18.22％.     

原核表达的PRSV HC-Pro 基因同源dsRNA 诱导番木瓜抗性的研究

 利用番木瓜环斑病毒（PRSV）HC-Pro 基因3′端824 bp 区段,通过OZ-LIC 法构建了含有PDK 内含子的发夹RNA 编码结构,并选用pSP73 和M-Jm109LacY 分别作为宿主载体和宿主菌,构建了高效的同源dsRNA 原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824,经IPTG 诱导表达的dsRNA 不被DNase I 和RNase A 降解,稳定性较好。采用喷洒dsRNA 粗制品的方式对番木瓜植株进行保护性处理和治疗性处理,症状观察及ELISA、Real-time RT-PCR 分析结果表明,保护性处理能有效诱发对番木瓜环斑病毒的抗性（发病率低,发病时间晚）;治疗性处理（植株已接种PRSV 25 d）能在处理初期引起番木瓜环斑病毒积累量发生短暂降低。     

2个番木瓜品种组培苗成苗率研究

[目的]寻找一种针对番木瓜成苗率高、商品苗质量优的育苗技术。[方法]选用番木瓜品种"梭罗"作为试验材料,MS为基本培养基,添加IBA、NAA、KT等生长调节剂,利用正交试验进行生长调节剂不同配比生根培养基组合筛选。[结果]最佳生根调节剂组合:IBA 0.75 mg/L,NAA 0.05 mg/L,KT 0.01 mg/L,其生根率为66.7%,但自育品种"蜜红"并未获得同样的效果。最佳生根水浓度为50 mg/L,其成苗率最高达86.1%。在不考虑时间成本情况下,生根水浸泡时间8 h,成苗率最高达87.5%。[结论]2个番木瓜品种成苗率基本一致。     

番木瓜CYP79A2基因片段的克隆与序列分析

苯丙氨酸氮羟化酶是植物中催化异硫氰酸苄酯(BITC)生物合成的第1个酶。笔者以番木瓜嫩叶总RNA反转录得到的cDNA为模板,依据拟南芥(NM-120608)和油菜(EU877074)的CYP79A2基因序列,并结合番木瓜的全基因组序列草图设计引物,进行PCR扩增,得到了大小为923bp的基因片段,命名为CP-CYP79A2。生物信息学分析结果表明,其为番木瓜的CYP79A2基因片段。为进一步研究番木瓜BITC的生物合成调控打下了良好的基础。     

我国番木瓜产业发展的关键问题及对策

针对我国番木瓜产业发展现状和制约我国番木瓜产业发展的关键问题以及现有产业发展研究基础,提出解决我国番木瓜产业发展的措施和途径,为我国番木瓜产业的健康和可持续发展提供决策依据。     

原核表达番木瓜环斑病毒NIa-Pro及其双重酶活鉴定

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)编码的核内涵体蛋白a蛋白酶(Nuclear inclusion body a proteinase,NIa-Pro)是一种多功能病毒非结构蛋白,在病毒侵染宿主及病毒与宿主互作中起着重要作用。本研究利用以麦芽糖结合蛋白(MBP)为融合表达框架的原核表达系统构建了表达NIa-Pro的重组载体pMAL-c5xNP,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导和Ni~(2+)-NTA-琼脂糖亲和层析纯化获得了可溶的重组融合蛋白MBP-NIa(N端和C端分别融合MBP和His标签),然后利用蛋白酶Factor Xa切去重组融合蛋白中的MBP,再通过直链淀粉树脂亲和层析纯化获得了可溶的重组蛋白NIa-Pro。活性检测结果表明,重组蛋白PRSV-NIa-Pro具有非特异的双链DNA酶和特异的蛋白酶双重活性。