新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。     

广东省首次发现野鼠型肾综合征出血热暨分型研究

对广东省1984～1993年收检冻存的肾综合征出血热隐性感染者和患者血清、鼠阳性血清及阳性鼠肺标本进行分型诊断。82例感染者、患者血清中检出家鼠型36例(43．9%)，野鼠型17例(20．7%)，未定型29例(35．4％)。38份鼠阳性血清中，褐家鼠28份、黄毛鼠3份、板齿鼠1份和臭鼩鼱分均为家鼠型，1例份黄毛鼠检出野鼠型，4份未定型。20份鼠肺中，除1份褐家鼠检出野鼠型外，其余均为家鼠型。首次发现我省有野鼠型肾综合征出血热存在，是以家鼠型为主的混合疫区．     

1990～1996年广东省人类狂犬病流行特征分析

1990～1996年广东省人类狂犬病的发病率逐年下降，从1992年开始，发病率基本控制在0．1／十万以下。为进一步了解我省狂犬病的流行动态，现将1990～1996年流行情况作一分析。     

广东省各类SARS病例标本实验室检测结果与临床诊断结果比较

目的 比较不同发病时间、有无明确接触史的SARS临床确诊病人和疑似病人实验室检测结果与临床诊断结果，分析实验室检测结果、流行病学资料和临床诊断之间的相互关系，为临床诊断提供更可靠的参考依据。方法 应用荧光定量PCR和巢式PCR技术检测病人咽拭子中SARS病毒特异基因，应用ELISA和间接免疫荧光法检测病人恢复期血清中的SARS病毒IgG抗体。结果 1～5月份，每月临床确诊病例PCR阳性率分别为：100％(2／2)、76．19％(16／21)、73．17％(30／41)、24．56％(14／57)和11．11％(2／18)，IgG抗体阳性率分别为100％(2／2)、78．57％(13／18)、58．33％(32／67)、30．30％(10／35)和9．52％(2／21)，阳性率逐月下降。4～5月份阳性率较低；1～4月份的临床确诊病例中，有明确接触史的病例，PCR和IgG抗体阳性率分别为73．58％(39／53)和74．42％(32／43)，无明确接触史的病例，PCR和IgG抗体阳性率分别为32．14％(27／84)和25．58％(22／86)，有无明确接触史临床确诊病例阳性率差异有显性。4～6月份，疑似病人PCR和IgG抗体的阳性率分别为11．89％(54／454)和7．78％(21／270)，阳性率很低。结论 综合临床症状、流行病学资料和实验室检测结果进行分析，可以得到更准确可靠的诊断结果。     

斑点热群立克次体广东分离株OmpA基因片段的克隆及序列分析

目的 鉴定斑点热群立克次体广东分离株GDFK58－2000和GDFK59－2000种属类型。方法 用PCR方法扩增GDFK58－2000和GDFK59－2000的OmpA基因起始部位533bp片段，克隆于pMD18-T载体并进行测序，测序结果与Genbank中其它斑点热群立克次体相应基因片段的核苷酸进行比较，用DNASTAR软件分析结果。结果 GDFK58－2000、GDFK59-2000和西伯利亚立克次体之间的核苷酸同源性为99.6%-99.8%，推断的氨基酸同源性为99.6%-99.8%，常用于分类鉴定的酶切位点完全一致。结论 两株广东分离株属于斑点热群立克次体的西伯利亚立克次体种。     

广东省传染性非典型肺炎病原体的分离鉴定及检测结果分析

目的 对引起广东省传染性非典型肺炎(SARS)的病原体进行分离鉴定，并分析各市首发病例、死亡病例、各个阶段病例的检测情况，为该病的诊断和防治提供依据。方法 对2003年1～5月份采自广州、肇庆、江门、汕头、中山、河源、珠海等地的SARS病例的咽拭子、咽漱液等标本，用Vero—E6、Vero、MDCK、Hep—2、传代人胚肺5种细胞进行分离培养，并使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、PCR及基因序列测定等方法对分离物进行鉴定，应用ELISA、荧光定量PCR等技术分别对各个阶段SARS病例的血清及咽拭子等标本进行检测。结果 5种细胞接种上述病人咽拭子标本后，均有部分出现细胞病变，电镜观察可找到冠状病毒样颗粒。分离物扩增出冠状病毒特异基因片断。分离物与病人恢复期血清抗体发生特异性反应。1～5月的病例标本SARS冠状病毒PCR阳性率分别为100．00％(2／2)、76．19％(16／21)、71．74％(33／46)、20．00％(18／90)、6．36％(11／173)；SARS冠状病毒抗体IgG阳性率分别为100．00％(2／2)、78．57％(11／14)、58．33％(14／24)、30．3％(10／33)、12．50％(9／72)。河源、佛山、肇庆、中山、东莞、珠海六市首发病例均检测出SARS冠状病毒I弗抗体。10个死亡病例中8例检测出SARS冠状病毒基因或相关抗体。结论 SARS冠状病毒是引起本次广东省SARS流行的主要病原体；不同时期SARS冠状病毒特异基因片断和抗体的检出率明显不同。     

科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立

目的建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,并在广东口岸进行应用。方法分析埃博拉病毒基因组的同源性,设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测。对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测,确定最佳的引物和探针组合、用量,以及Mg~(2+)用量,建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查。结果经筛选,引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对10~2~10~5拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0%,是最佳的引物和探针组合。优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg~(2+)终浓度为2 mmol/L。方法的灵敏度为50拷贝/ml,重复性好、特异性强,对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性。结论建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义。     

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的　建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法　采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果　采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论　该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

广东省斑点热群立克次体自然疫源地调查

目的　了解广东省是否存在斑点热自然疫源地。方法　用血清流行病学方法调查广东省人群、宿主动物感染状况 ;用聚合酶链反应初筛 ,鸡胚卵黄囊培养法直接从标本中分离立克次体 ;用血清学试验、序列测定对分离株进行鉴定。结果　检测 86 0份自然人群及 32 1份鼠类血清标本 ,发现健康人群平均阳性率为 3.84 % ,各调查点之间的阳性率差异有显著性 (χ2 =6 0 2 .39,df =8,P <0 .0 1) ,山区和平原阳性率差异无显著性 (χ2 =0 .32 ,df =1,P >0 .0 5 ) ;鼠类阳性率为 4 .6 7% ,针毛鼠、白腹巨鼠、板齿鼠的阳性率分别为 11.5 9%、12 .90 %和 3.13% ;在针毛鼠、白腹巨鼠、板齿鼠发现斑点热自然感染抗体是国内首次报道 ;采集鼠脾标本 32 1份 ,未分离出菌株 ;自鼠体表采集到蜱 394匹 ,从2只针毛鼠体表采集的蜱中分离到 2株斑点热群立克次体 ,命名为GDFK5 8 2 0 0 0株、GDFK5 9 2 0 0 0株 ,经血清学鉴定为西伯利亚种 ,对GDFK5 8 2 0 0 0和GDFK5 9 2 0 0 0的OmpA基因起始部位 5 33bp片段进行克隆和测序 ,测序结果与Genbank中其他斑点热群立克次体相应基因片段的核苷酸进行比较 ,GDFK5 8 2 0 0 0、GDFK5 9 2 0 0 0和西伯利亚立克次体之间的核苷酸同源性为 99.6 %～ 10 0 % ,推断氨基酸同源性为 10 0 %。结论　从宿主动