多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。     

一起由H3N2流感病毒引起的局部流感暴发的病原学研究

目的 对一起流感局部暴发的病原体进行分离并鉴定，研究其变异情况，为流感的预防和控制提供依据。方法 用MDCK细胞对病人的咽拭标本进行分离培养，并对分离到的流感病毒HAl基因核苷酸序列进行测定及抗原分析。还检测了患者的血清抗体水平。结果在22份病人的咽拭标本中，分离到3株H3N2亚型流感病毒，患者恢复期血清抗体水平较急性期抗体水平升高4倍。将其中1株的HAl基因测序，与国际代表株进行比较，并与国际代表株进行交叉血抑试验，表明分离到的流感病毒发生抗原漂移。结论这种变异具有流行病学意义，造成甲3亚型流感病毒在湛江地区的局部暴发。     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及抗原性分析

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,并对其抗原性进行鉴定。方法利用PCR技术从HIV-1全基因质粒(BH-10)中扩增p24抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳检测插入基因片段的正确性,并用W estern B lot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。结果PCR产物和构建的重组质粒pET22b-p24经双酶切插入的外源基因片段均为690 bp,与预期p24抗原全基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE电泳,可见1条相对分子量约26×103的外源表达蛋白带,与预期大小一致,未见杂蛋白带。WB结果显示重组蛋白与HIV-1阳性血清呈特异性反应,与健康人血清没有反应。ELISA检测p24抗原灵敏度为93.94%(62/66),特异性为93.33%(28/30)。结论构建了HIV-1 p24表达载体pET22b-p24,并在原核细胞中高效表达,其表达产物具有良好的抗原性,为研制HIV抗体确认试剂奠定了良好的基础。     

广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法

[目的]建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系。[方法]设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系。[结果]5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp，A＋T含量为68．77％-70．6％。同源性比较表明，不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数，核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85．1％-93．7％和92．0％-99.3％。COI核苷酸系统进化关系显示，所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合，但骚扰阿蚊位于一单独的分支上，其亲缘关系与其它蚊种最远。COI基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致，库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科，中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系最远。[结论]建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分，后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

诺如病毒快速检测方法的建立及其在国境卫生检疫中的应用

目的:建立快速、特异的诺如病毒实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR相结合检测方法,对人感染诺如病毒进行快速检测。方法:根据国外最新流行的诺如病毒核酸序列,设计并合成诺如病毒基因扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件,制定出快速、灵敏检测诺如病毒核酸的实时荧光RT-PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法。结果:实验证明,本方法将实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测方法相结合,能在5 h内快速确认诺如病毒,检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏的特点,且具有较高的特异性和重复性。结论:本实验室利用本方法,首次在广州某国境口岸从外籍发热船员样本中检出5例输入性GGⅡ群诺如病毒。该方法对防止诺如病毒传入我国,保障我国国境卫生安全具有重要意义。     

一起外轮聚集性诺如病毒感染事件的病原学检验

目的报告一起入境外籍船员聚集性非细菌性食物中毒事件的病原学检验。方法采集该外轮11名船员的样本，应用实时荧光RT-PCR方法对样本进行核酸检验，结果呈阳性的样本应用RT—PCR方法进行验证，PCR产物进行测序并做序列分析。结果从11份样本中检出5例诺如病毒GGⅡ-4群阳性。结论引起此次外籍船员腹泻爆发的病原体为GGⅡ-4群诺如病毒。Real—time RT—PCR方法检验诺如病毒快速、准确、特异性强。此次为中国检验检疫机构首次从国境口岸检出诺如病毒。     

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区（rDNA-ITS2）分子鉴定方法及其系统进化关系。[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性，设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同，M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp-520bp、432bp-438bp、527bp-586bp、439bp-448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示，尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属，再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科，库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类，分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

登革重组抗原与登革IgG抗体反应的敏感性和特异性分析

目的对登革重组包膜蛋白(E蛋白)抗原与登革病毒IgG抗体反应的敏感性和特异性进行评估和分析。方法将登革1-4型重组E蛋白抗原包被ELISA反应板,用间接法ELISA检测登革病人及其它血清样本登革病毒IgG抗体。结果重组抗原能检测出登革病人体内IgG抗体水平和变化情况,对2004年中山登革热疫情病人恢复期血清IgG抗体检出率达100%,无一漏检;在曾流行过登革热的疫区,能检出登革病毒IgG抗体阳性血清;重组抗原与乙脑病人血清没有交叉反应;评估结果显示“登革病毒IgG抗体检测试剂”的灵敏度为95·93%,特异度为96·86%。结论登革1-4型重组E蛋白抗原对登革病毒IgG抗体具较高的敏感性和特异性,可作为“登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒”开发的原材料。     

基孔肯雅病毒实验室检测方法研究进展

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒引起的一种急性虫媒传染病,基孔肯雅病毒属甲病毒属,披膜病毒科。近年来,该病毒曾引起全球多处疫情暴发,并造成全球性的公共卫生问题。本文对基孔肯雅病毒及其实验室检测方法作一综述,以指导国内开展对该病的检测。     

输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异分析

目的分析口岸输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征及变异趋势,及早发现变异株。方法选取广东口岸入境人员中检出的64份输入性甲型H1N1流感阳性样本,对其病毒NA基因进行核苷酸序列测定。与2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1N1的NA基因序列进行对比,对甲型H1N1流感病毒的NA基因进化树、核苷酸序列同源性、氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化等进行分析。结果 NA基因进化树分为3个分支,其中2009年、2010年病毒聚集成簇位于分支1,2011年病毒则与部分2010年检出的病毒位于较远距离的分支2和3。检出的1例病毒NA氨基酸的抗原决定簇上发生Y155H的变异,部分病毒NA蛋白在42位点上新增了一个糖基化位点,在68、386位点出现了糖基化位点的缺失。氨基酸G41R、V106I、V241I、N248D、I365T、N369K等位点的变异较为显著,但未见耐奥司他韦病毒的出现。结论甲型H1N1流感病毒NA基因已发生一定程度的变异。随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性和耐药性,从而引起新的流行。