广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区（rDNA-ITS2）分子鉴定方法及其系统进化关系。[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性，设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同，M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp-520bp、432bp-438bp、527bp-586bp、439bp-448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示，尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属，再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科，库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类，分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异分析

目的分析口岸输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征及变异趋势,及早发现变异株。方法选取广东口岸入境人员中检出的64份输入性甲型H1N1流感阳性样本,对其病毒NA基因进行核苷酸序列测定。与2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1N1的NA基因序列进行对比,对甲型H1N1流感病毒的NA基因进化树、核苷酸序列同源性、氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化等进行分析。结果 NA基因进化树分为3个分支,其中2009年、2010年病毒聚集成簇位于分支1,2011年病毒则与部分2010年检出的病毒位于较远距离的分支2和3。检出的1例病毒NA氨基酸的抗原决定簇上发生Y155H的变异,部分病毒NA蛋白在42位点上新增了一个糖基化位点,在68、386位点出现了糖基化位点的缺失。氨基酸G41R、V106I、V241I、N248D、I365T、N369K等位点的变异较为显著,但未见耐奥司他韦病毒的出现。结论甲型H1N1流感病毒NA基因已发生一定程度的变异。随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性和耐药性,从而引起新的流行。     

新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。     

科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立

目的建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,并在广东口岸进行应用。方法分析埃博拉病毒基因组的同源性,设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测。对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测,确定最佳的引物和探针组合、用量,以及Mg~(2+)用量,建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查。结果经筛选,引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对10~2~10~5拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0%,是最佳的引物和探针组合。优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg~(2+)终浓度为2 mmol/L。方法的灵敏度为50拷贝/ml,重复性好、特异性强,对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性。结论建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义。     

荧光定量PCR检测细菌NDM-1基因方法的探讨

目的:将Taqman荧光定量PCR技术与SYBRGreen染料RT-PCR技术比较后,应用于检测细菌NDM-1基因。方法:使用Taqman荧光定量PCR方法与SYBRGreen染料RT-PCR对已知特性的标准株中NDM-1基因检测,对比其扩增灵敏度。结果:Taqman荧光定量PCR技术灵敏度高于SYBRGreen染料RT-PCR法,所测标准株中NDM-1基因转录水平可高达7.5×104拷贝/μl,比SYBRGreen染料RT-PCR技术检测灵敏度高7.8倍。结论:Taqman荧光PCR技术对超级耐药菌NDM-1基因具有较高的敏感性和准确性,可以作为对超级细菌进行监控与防控的方法。     

裂谷热流行现状和检测研究进展

裂谷热是由裂谷热病毒引起的一种急性、烈性人畜共患疾病,主要影响绵羊、山羊和牛等牲畜,可以引起病畜死亡和流产,发病率与死亡率较高;同时也能传染人类,裂谷热传播途径主要通过人直接或间接接触被感染动物的血液或器官导致感染,人被携带病毒的蚊子叮咬也会受感染。裂谷热疫情主要在非洲地区流行,近年来已延伸至阿拉伯半岛,但目前为止,我国未见裂谷热疫情发生。为此笔者综合国内外文献,就裂谷热的流行特点、各种检测技术以及预防控制方面进行综述,为进一步开展裂谷热相关研究及口岸监测提供参考,降低疫情传入我国的风险。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

黄热病现状分析及研究进展

黄热病是黄病毒科、黄病毒属的黄热病病毒引起的急性传染病,经蚊媒传播,主要发生在非洲和美洲地区,严重威胁人类健康。目前该病尚无特效药治疗,接种疫苗是最好的预防途径。虽然亚洲地区尚未发现黄热病,但随着全球经济的发展,国际间的人群交往更为便利,全球贸易一体化和都市化生活等因素使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。我国应长期保持警惕,及时预防、控制该病通过国境口岸传入。本文就黄热病流行病学、预防控制,以及疫苗研究等情况进行了综述。     

一起外轮群体性腹泻事件的实验室检测及分析

目的调查一起外籍船员群体性腹泻的原因,及时采取相应措施防止腹泻疫情进一步扩散,并防止对环境可能造成的污染。方法结合流行病学调查结果,采集腹泻船员的肛拭子、粪便样本,处理后利用实时荧光PCR法对样本同时进行沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7的检测;同时对以上样本进行增菌和分离培养;分离出的菌株进行生化鉴定和血清学分型。结果实时荧光PCR检测结果显示,14份样本(12份肛拭子、2份粪便)中13份沙门氏菌检测阳性,1份阴性,其他指标检测均为阴性;阳性样本中分离到的特征性菌落均符合沙门氏菌生化反应特征;血清学反应结果显示,以上菌株为沙门氏菌Ⅱ型。但从该外籍船上采集的食品、饮用水及环境样本中均未检出沙门氏菌。结论引起本次群体性腹泻事件的原因为沙门氏菌Ⅱ型感染。