496例腹泻患者粪便细菌培养与耐药性分析 FREE

目的分析西安地区第四军医大学唐都医院2004-2008年腹泻患者粪便标本分离的细菌种类及耐药性。方法采用Microscan WalkAway 40全自动微生物分析仪对上述标本菌株进行鉴定及药敏分析,药敏试验采用K B纸片扩散法,结果根据美国临床实验室标准化研究所2006年版标准判定。结果粪便致病菌及异常优势菌培养阳性率为36.63%。检出的496株细菌中,革兰阳性（G+）菌163株(32.86%),革兰阴性（G-）菌299株(60.28%),真菌34株(6.85%);G+菌以肠球菌属(154株,94.48%)为主,G-菌以志贺菌属(136株,45.48%)为主。肠球菌属对利奈唑胺和万古霉素有较高敏感性,敏感率为96.10%～100.00%;志贺菌属对亚胺培南、头孢哌酮、头孢曲松和庆大霉素有较高敏感性,敏感率为81.62%～100.00%。结论了解腹泻患者粪便病原菌的分布特征及其耐药性,对有效控制感染及耐药菌株的产生具有十分重要的临床意义。     

人DC的获取与DC特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素的表达

目的：证实体外诱导分化的人树突状细胞（DC）表面高效表达树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子（DC-SIGN），为进一步研究其在丙型肝炎病毒传播中的作用奠定基础。方法：Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），黏附2h后接种于完全培养液中，并加入rhGM-CSF、rhIL-4刺激分化，共培养7天，光镜及扫描电镜观察细胞形态，以DC表面特异性标志DC-SIGN的特异性抗体进行荧光染色，检测DC-SIGN的表达。结果：经诱导产生的细胞具有典型的DC形态特征，高表达DC特异性标志物DC-SIGN。结论：GM-CSF与IL4联合刺激PBMC可分化为DC，且高表达DC-SIGN，为后续研究DC-SIGN奠定了基础。     

汉坦病毒内化作用研究进展

内化是生物大分子(包括细菌、病毒等)进入细胞内的膜泡转运过程。病毒内化是其复制、致病、抗原加工呈递和诱发机体免疫应答的前提,对研究病毒性疾病的发病机制具有重要意义。汉坦病毒主要通过受体介导的包涵素被覆小凹途径进入细胞。     

汉坦病毒G1和G2糖蛋白的基因克隆及糖蛋白杆状病毒表达载体的构建

目的：克隆汉坦病毒G1和G2糖蛋白基因,构建基于杆状病毒表面展示系统（BSDS）的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒.方法：用PCR方法扩增汉坦病毒西安分离毒株84FLi株G1和G2糖蛋白基因的编码区,将其克隆入T载体,构建糖蛋白基因的T-A克隆.然后将糖蛋白编码区从T-A克隆中切下,插入杆状病毒表达转移载体pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.结果：获得四个分别含有汉坦病毒G1和G2糖蛋白编码区的T-A克隆,并构建成功G1和G2糖蛋白的杆状病毒表达质粒.结论：构建成功基于BSDS的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒,为进一步用BSDS表达汉坦病毒糖蛋白奠定了基础.     

3种丙型肝炎病毒结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建鉴定及表达

目的：构建能表达HCV不同结构基因（C、C E1、C E1 E2）的腺病毒表达载体的穿梭质粒，为进一步包装能高效表达HCV不同结构蛋白的腺病毒载体做准备。方法：用分别含有Bg1 Ⅱ及HindⅢ酶切位点的HCV不同片段结构基因上、下游引物，以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV-3011为模板，通过PCR扩增获得HCV3种不同结构基因片段，基因片段回收后，分别以BglⅡ及Hing Ⅲ双酶切，定向插入到腺病毒穿梭质粒Pad.CMV-Link.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与HindⅢ位点之间。获得3种重组腺病毒穿腺病毒穿梭质粒pad.HCV-C、Pad.HCV-CE1和Pad.HCV-S(C E1 E2)。通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切，聚合酶链反应（PCR）及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定，以抗HCV C单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法及Western Blot检测了3种穿梭质粒在HepG2细胞中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，3种穿梭质粒的插入片段分别为HCV C、C E1和C E1 E2区基因片段，免疫荧光及Western Blot法检测表明其可以在HepG2细胞中瞬时表达。结论：构建的3种腺病毒穿梭质粒分别可以表达HCV不同段的结构基因，为包装表达HCV不同结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后 ,形成永生化的B淋巴母细胞系 (B LCL)。B LCL在体外能无限增殖 ,广泛应用于医学生物学研究领域。本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B LCL应注意的问题以及B LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.