RNAi技术抑制HCMV-IE1表达的在体实验研究

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi) 对体内人类巨细胞病毒-立即早期基因1(human cytomegalovirus immediate-early gene 1,HCMV-IE1)表达的沉默作用,为靶向HCMV-IE1的基因治疗提供科学的实验依据.方法:选取60只雄性昆明种小鼠,并分为3组,分别为实验对照组(注射生理盐水)、病毒感染组(注射HCMVAD169株病毒液)和RNA干扰组(染毒后第2天注射转染了表达RNAi载体的人胚肺成纤维细胞液);采用PCR法检测小鼠体内HCMV基因的表达水平;采用ELISA检测动物血清中HCMV-IgM的含量;采用免疫组织化学和Western免疫印迹技术分别测定小鼠体内HCMV-IE1的蛋白水平.结果:PCR结果表明干扰组比病毒感染组的HCMV的基因表达下调20%;ELISA结果表明RNAi能使动物血清中HCMV的含量降低为19%;免疫组织化学和Western免疫印迹结果证实,干扰组和病毒感染组的HCMV-IE1蛋白水平分别降低为17.6%和18.5%.结论:RNAi技术能有效地抑制目的基因在体内的表达,有可能用于靶向HCMV-IE的基因治疗.     

微小RNA-146a影响血管平滑肌细胞增殖和凋亡的机制*☆◆

背景：微小RNA-146a通过负调控核因子κB信号通路介导免疫细胞和肿瘤细胞的增殖,但是否参与血管平滑肌细胞的增殖或凋亡未见研究报道。 目的：观察微小RNA-146a对血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。  方法：采用脂质体2000将50 nmol/L微小RNA-146a反义寡核苷酸转染至大鼠血管平滑肌细胞,以转染错义链及PBS的细胞作为对照。  结果与结论：微小RNA-146a反义寡核苷酸转染48 h后,血管平滑肌细胞增殖减少(P < 0.01)、凋亡增多(P < 0.05),细胞的微小RNA-146a水平明显降低(P < 0.01),核因子κBp65、增殖细胞核抗原蛋白表达明显降低(P < 0.05)。说明微小RNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖,抑制凋亡,其机制与增加核因子κBp65表达有关。关键词：微小RNA-146a;血管平滑肌细胞;核因子κB;转染;增殖;凋亡 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.20.024     

血清蛋白质组技术及其在预防医学中应用

随着生命科学进入后基因组研究时期,蛋白质组研究应运而生.而血清蛋白质组就是其中一个分支,它是在建立正常蛋白质表达图谱的基础上,寻找目标人群血清差异蛋白质点,研究与疾病相关蛋白质的结构和功能.这些研究将有利于阐明疾病发病机制,并可能发现与疾病特定状态相关的标志性蛋白质,为研究重大疾病病理生理学机制、早期诊断的特异性标志物、病程及疗效监测、药物作用靶点等开辟了新途径,在疾病诊断和防治方面有着广泛的应用[1-2].     

毛细管电泳法检测耐米托蒽醌乳腺癌细胞系全基因组甲基化水平

目的： 建立对米托蒽醌(Mit)耐药的乳腺癌MCF-7细胞系,并探讨乳腺癌细胞产生耐药与其基因组甲基化水平之间的关系。方法：用0.005、0.010和0.020 μmol/L浓度的米托蒽醌染毒乳腺癌MCF-7细胞,建立对米托蒽醌不同耐药程度的MCF-7耐药细胞系,采用流式细胞术检测各染毒组MCF-7细胞内药物荧光强度D(755)值,确定Mit耐药细胞系的建立;提取各组细胞的DNA, 利用毛细管电泳法检测野生型对照组及各染毒组细胞全基因组DNA甲基化水平。结果：野生型对照组、0.005、0.010和0.020 μmol/L米托蒽醌染毒组的D(755)值依次为16.1±0.04、14.3±0.12、13.3±0.07和9.7±0.08,与野生型对照组相比,随着药物染毒浓度的增加,MCF-7细胞内药物的D(755)值逐渐减少,其中0.020 μmol/L染毒组较对照组显著减少,差异有统计学意义 (P<0.05),表明细胞耐药性增强;而上述各组DNA甲基化水平依次为42.25%±0.64%、37.97%±1.18%、34.27%±0.14%、31.16%±0.80%,与野生型对照组相比,各染毒组细胞基因组DNA甲基化水平逐渐降低 (P<0.05),且各染毒组间两两比较差异均具有统计学意义 (P均<0.05)。结论：成功建立了对Mit耐药的MCF-7细胞系;确定了毛细管电泳法检测基因组DNA甲基化水平的电泳分离条件。     

带TAP标签的癌蛋白SET真核载体的构建及其表达

背景与目的: 为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP。 材料与方法: 从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SET基因,从质粒中扩增得到TAP基因,采用重叠PCR法将基因SET与TAP连接成SET-TAP,双酶切后纯化序列定向克隆至pcDNA3.1/zeo(+)并转化E.coli DH 5α ,取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,重组质粒瞬时转染L-02肝细胞进行表达,Real Time-PCR和Western blotting检测融合蛋白的表达。 结果: 经双酶切和DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1/SET-TAP真核表达载体构建成功,将该载体转染L-02细胞后,融合蛋白在肝细胞中获得高效表达。 结论: 该结果为研究SET在三氯乙烯致肝细胞毒性的蛋白质相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机制奠定了基础。     

鼻咽癌FRA3B脆性部位的微卫星不稳定性分析

目的 探讨鼻咽癌染色体脆性部位FRA3B区域的微卫星不稳定性（Microsatellite Instability,MSI）。方法 选择FRA3B区域附近的6个微卫星多态标记对30例鼻咽癌进行MSI分析。结果 MSI的发生率为63．33％（19／30）,其中复制错误（Replication Errors,RER)阳性率为36．67％（11／30）。MSI频率较高的3个位点为D3S1547（30．8％）、D3S1313（34．6％）和D3S1300（37．5％）。临床Ⅰ－Ⅱ期患者MSI频率高于Ⅲ－Ⅳ期（P＜0．05）。结论 提示FRA3B脆性部位的MSI为鼻咽癌形成过程中的早期分子事件,可能参与了鼻咽癌的发病。     

反义抑制miR-222表达对替莫唑胺所致神经胶质瘤细胞DNA损伤作用的影响北大核心CSCD

目的探讨miR-222低表达的神经胶质瘤细胞(T98G-miR-222-)对替莫唑胺(TMZ)的DNA损伤反应。方法运用脂质体Lipofectamine 2000将anti-miR-222和anti-NC分别转染至T98G细胞后,分别用0、100、200、400和800μmol/L的TMZ处理转染T98G细胞,运用Northern blot等检测miR-222表达水平;以单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤指标彗性尾长。结果 TMZ引起T98G细胞DNA损伤指标彗星尾长增加,且有一定的剂量效应关系;anti-miR-222处理T98G细胞的DNA损伤指标彗星尾长显著高于同一剂量处理的anti-NC细胞。结论反义抑制miR-222表达可增强替莫唑胺所致神经胶质瘤细胞DNA损伤。     

P-gp基因突变与乳腺癌多药耐药分子机制的研究

目的 探讨P-糖蛋白（P-gp）基因突变与乳腺癌多药耐药的关系。方法 本组自2004年3月至2006年4月采用MTT法检测52例乳腺癌标本对四种化疗药物的敏感性,PCR扩增P-gp基因中最常发生突变的250个碱基进行单链构象多态性（SSCP）分析,将其核苷酸序列与野生型P-gp基因进行比较。结果 52例乳腺癌组织中8例对四种抗癌药物均敏感,无P-gp基因突变;19例对一种抗癌药物耐受,其中仅一例P-gp基因发生点突变;16例对两种抗癌药物耐受,其中两例发生P-gp基因点突变;7例和2例分别对三种抗癌药物耐受和四种抗癌药物耐受,它们的P-gp基因都发生了点突变。P-gp基因突变位点分别为891gly位（GGC→GAC）asp和1145位his（CAC→TAC）tyr。结论 P-gp基因突变介导乳腺癌多药耐药,P-gp基因产物891位gly（GGC→GAC）asp和1145位his（CAC→TAC）tyr的突变与乳腺癌多药耐药密切相关。     

大气PM2.5对人支气管上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨PM_2.5暴露后,人支气管上皮细胞（16HBE）的增殖和凋亡的变化,研究PM_2.5对16HBE细胞的影响。方法 将16HBE细胞暴露于0、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL PM_2.5悬浮液,24 h后加入CCK-8,3~4 h后用酶标仪在450 nm处测量OD值,并计算细胞存活率。将16HBE细胞暴露于0、50、100、200、400、800 μg/mL PM_2.5悬浮液,24 h后加入hoechst33342染色25 min、PI染色30 min,显微镜下观察调亡的细胞并计数,计算细胞凋亡率。结果 PM2.5暴露24 h后,50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL组细胞存活率显著下降,分别为（89.41±5.53）%、（75.71±5.99）%、（82.99±15.09）%、（61.74±9.88）%、（57.23±3.28）%、（46.00±4.23）%、（42.63%±7.79）%,有剂量效应关系,与对照组相比,差异均具有统计学意义（P均<0.01）。PM _2.5对16HBE细胞的24 h半数致死浓度（LC₅₀）为（762.03±180.25）μg/mL。PM_2.5暴露24 h后,在镜下计数各剂量组调亡细胞,细胞凋亡数量随着剂量升高而增高,0、50、100、200、400、800 μg/mL组细胞调亡率分别为（10.50±2.64）%、（17.90±4.63）%、（21.30±2.26）%、（32.10±4.18）%、（36.90±3.25）%、（50.30±5.81）%,有剂量效应关系,与对照组相比,差异均具有统计学意义（P均<0.01）。结论 PM _2.5对16HBE细胞有毒性作用,可导致16HBE细胞增殖受到抑制,凋亡增加。     

二氧化硅对人支气管上皮细胞TGF—β1基因产物表达的影响分析

目的分析人支气管上皮细胞（16HBE）在二氧化硅（SiO2）粉尘染毒后TGF-β1基因产物的表达情况,为探索矽肺新的治疗途径提供基础资料。方法以16HBE作为靶细胞,以灭菌SiO2粉尘配置30μg／ml及60μg／ml两种不同浓度的悬浮液（以含10％FBS的DMEM培养基定溶）,以不同浓度的SiO2粉尘悬液分别培养16HBE靶细胞8h、16h、24h、32h,各做三个平行实验孔,同时,做10％FBS的DMEM空白对照;以免疫细胞化学方法检测TGF—β1基因产物的表达。结果在经30ug／ml及60ug／mlSiO2粉尘悬浮液培养8h、16h、24h、32h后,各实验孔16HBE细胞扫描灰度值均较对照组细胞低,结果提示,16HBE细胞经SiO2粉尘染毒后TGF—β1基因产物表达增加。结论体外实验条件下,SiO2粉尘可上调16HBE细胞TGF-β1基因产物的表达。