大鼠C6脑胶质瘤模型的建立

目的通过不同方法建立大鼠脑胶质瘤模型,观察其生长特性,比较各种方法的优劣。方法体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,分别取浓度为1.0×105个/10μl、1.0×106个/10μl、1.0×107个/10μl细胞悬液,立体定向接种于Wistar大鼠脑右侧尾状核区,观察不同接种量实验鼠的生存状态、成瘤情况及脏器转移灶,并采用免疫组织化学方法检测其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果各种接种量的实验组成瘤率均为100%,未见颅外转移病灶,在组织病理学上接近人脑胶质瘤,瘤细胞病理性核分裂像多见,GFAP蛋白呈散在阳性表达,VEGF蛋白呈强阳性表达,瘤组织内有出血和坏死以及丰富的微血管。实验周期短,重复性高。结论C6细胞接种Wistar大鼠脑胶质瘤动物模型,肿瘤成瘤率高,颅内生长稳定,肿瘤组织病理学特性与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。实验范围内部分时段不同接种剂量肿瘤生长速度有显著性差异,可根据病因学、实验治疗或药效学等不同研究需要选择不同接种量。     

U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型建立

目的建立U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤温度变化情况。方法将U87胶质瘤细胞接种到Balb/c裸鼠右侧背部靠右后肢皮下处,建立10只雌性裸鼠皮下移植瘤胶质瘤模型。测量肿瘤的体积,并绘制肿瘤生长曲线。观察神经胶质瘤的生长,监测肿瘤温度的变化情况。接种第36天处死裸鼠,取出肿瘤组织观察肿瘤标本的病理性特征和GFAP免疫组化的阳性表达情况。结果胶质瘤裸鼠模型建立成功。病理学检查显示,肿瘤细胞符合胶质瘤细胞的形态学特征,GFAP阳性表达。在成瘤初期,肿瘤温度随时间增加而逐渐增加,到接种第15天,肿瘤温度上升至最高,在肿瘤生长后期,肿瘤温度随着时间增加而降低。接种第36天裸鼠肿瘤温度与接种第6天裸鼠肿瘤温度相比较差异有统计学意义(P0.05)。结论有效建立U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型,在胶质瘤治疗方面有广泛的用途。     

大鼠脑胶质瘤模型建立与生长评估

目的建立SD大鼠脑胶质瘤动物模型,比较其生长评估方法。方法采用立体定向技术,将体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞浓缩悬置,调制为浓度5×1011/L的无血清RPMI1640培养液,将20μl悬液接种于SD大鼠右侧尾状核区。接种后分时段观察与评估实验鼠的神经功能缺损、肿瘤的生长特性、MRI检查结果,并做组织病理学和胶质纤维酸性蛋白及S-100蛋白免疫组化检查。结果立体定向技术接种的大鼠脑胶质瘤动物模型具有颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移,实验周期短,可重复性好,组织学上接近人脑胶质瘤等特征。神经功能评分与荷瘤鼠的脑胶质瘤大小及生长进程具有相关性。结论建立的SD大鼠的C6脑尾状核胶质瘤模型,其肿瘤影像及病理特征与人脑胶质瘤相似,神经功能评分可作为其生长的间接评估方法。     

白藜芦醇对裸鼠U87细胞移植瘤生长及血管生成的影响

目的 研究白藜芦醇(Res)对人脑胶质瘤系U87细胞的体内抗癌活性及血管生成的影响. 方法 BALB/c裸鼠20只,背部皮下接种胶质瘤细胞U87建立皮下移植瘤模型.随机数字表法分为10、100mg/kgRes治疗组,溶剂对照组,空白对照组,每组5只.观察4组裸鼠移植瘤的生长曲线并应用免疫组织化学法检测瘤组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达:采用原位末端标记法(TUNEL)检测瘤组织细胞的凋亡. 结果与空白对照组及溶剂对照组相比,100 mg/kg Res治疗组裸鼠移植瘤的体积、重量降低;100 mg/kg Res治疗组瘤组织中MVD、VEGF的表达明显降低,凋亡细胞数增高,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 Res对U87人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用,这可能与Res导致U87移植瘤细胞凋亡及血管生成减少有关.     

白藜芦醇对裸鼠U87细胞移植瘤生长及血管生成的影响

目的 研究白藜芦醇(Res)对人脑胶质瘤系U87细胞的体内抗癌活性及血管生成的影响. 方法 BALB/c裸鼠20只,背部皮下接种胶质瘤细胞U87建立皮下移植瘤模型.随机数字表法分为10、100mg/kgRes治疗组,溶剂对照组,空白对照组,每组5只.观察4组裸鼠移植瘤的生长曲线并应用免疫组织化学法检测瘤组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达:采用原位末端标记法(TUNEL)检测瘤组织细胞的凋亡. 结果与空白对照组及溶剂对照组相比,100 mg/kg Res治疗组裸鼠移植瘤的体积、重量降低;100 mg/kg Res治疗组瘤组织中MVD、VEGF的表达明显降低,凋亡细胞数增高,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 Res对U87人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用,这可能与Res导致U87移植瘤细胞凋亡及血管生成减少有关.     

反义miR-21抑制异种移植U87人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤生长的疗效和机制.方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)治疗裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21的治疗效果.使用RT-PCR和原位杂交方法 鉴定治疗后miR-21表达水平,采用HE染色和免疫组织化学染色(增殖细胞核抗原、细胞周期抑制因子-21、基质金属蛋白酶-9和隔蛋白-7)评价治疗后肿瘤生物学性状的变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积明显小于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=6.056,P=0.007);RT-PCR检测显示AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的(0.031±0.008)%;原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照组与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数明显高于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=141.021,P=0.000). 结论 以miR-21作为靶点治疗异种移植U87人脑胶质瘤效果令人满意,miR-21可作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

蛇毒解聚素在裸鼠胶质瘤模型中的干预治疗作用研究

目的研究蛇毒解聚素（CN）对裸鼠人脑胶质瘤动物模型的治疗可行性,探讨蛇毒解聚素抑制U87胶质瘤裸鼠移植瘤生长的作用机制。方法建立BALB／c裸鼠U87胶质瘤移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为2组,采用间质内注射给药方法。蛇毒解聚素按40μg每次给药。定期观察肿瘤生长情况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。全部BALB／c裸鼠移植瘤石蜡标本用SP法免疫组化染色,检测移植瘤组织中的微血管计数（MVD）,Ki-67标记指数以及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。结果与溶媒对照组相比,蛇毒解聚素组均能抑制肿瘤生长（P〈0．01）,其体积抑瘤率为50％,并能明显降低肿瘤微血管密度、能下调移植瘤组织中bFGF的蛋白表达及Ki-67标记指数。结论蛇毒解聚素能明显抑制U87裸鼠移植瘤生长。     

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的研究Survivin拮抗肽对裸鼠脑胶质瘤的抑制效应。方法将体外培养的人胶质瘤U251细胞经立体定向技术注入裸鼠脑尾状核区域,构建荷U251胶质瘤裸鼠原位模型。荷瘤11d后,随机分成实验组和对照组,分别经腹腔注射Survivin拮抗肽、生理盐水,30d后全部处死,制作病理切片和HE染色。应用Olimpus CX41显微镜图像分析系统,计算在肿瘤组织的最大切面上,肿瘤坏死面积与肿瘤面积的比值。结果 Survivin拮抗肽实验组裸鼠的肿瘤坏死面积与肿瘤面积的比值大于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长具有抑制效应。     

颅内胶质瘤模型建立及肿瘤生长特征观察

目的建立Wistar、SD大鼠及BALB/c小鼠脑胶质瘤动物模型,比较其颅内肿瘤生长特点.方法借助动物立体定向仪,将体外培养大鼠C6胶质瘤细胞(细胞数为3×105个,悬浮于无血清DMEM培养液60 μl中)分别接种于Wistar、SD大鼠左侧尾状核区, BALB/c小鼠左顶枕区(接种细胞数为1×103).接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,分别于接种后5、15 d进行MRl检查.在实验3 d、6 d、9 d、12 d、15 d时解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化检查.结果两种大鼠脑胶质瘤动物模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤.而且具有颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好.而BALB/c小鼠成瘤率76.67%.结论接种的Wistar、SD两种大鼠脑胶质瘤动物模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似.均可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型.而BALB/c小鼠则需进一步探索.     

立体定向大鼠脑胶质瘤颅内接种生长情况的观察

目的通过建立类似于人脑胶质瘤的动物模型,观察颅内肿瘤生长特点。方法借助动物立体定向仪,将体外培养大鼠C6胶质瘤细胞(细胞数为3×105个,悬浮于无血清DMEM培养液60μL中)接种于Wistar大鼠左侧尾状核区。接种后观察实验大鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,分别于接种后5、14 d进行MRI检查。在实验3、6、9、121、5 d时解剖标本,做组织病理学和GFAP免疫组化检查。结果该方法建立的胶质瘤动物模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤.而且颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好。结论C6大鼠脑胶质瘤动物模型肿瘤生长及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。     

人脑肿瘤组织块裸小鼠原位移植方法研究及移植瘤的亲本特征分析

目的 用肿瘤组织块直接接种法建立人脑肿瘤裸小鼠原位移植模型,通过分析移植瘤的生物学特征来证明本操作方法 的可行性. 方法 取人肺腺癌脑转移瘤的新鲜组织或人脑多形性胶质母细胞瘤(GBM)裸小鼠皮下移植瘤组织,剪成小块,置入专用套管针,通过事先钻好的颅骨孑孔,徒手推入裸小鼠右尾状核.观察致瘤率、移植瘤的组织细胞形态、相关标志物、MRI图像特征和荷瘤鼠生存期. 结果肺腺癌脑转移瘤和GBM组织在鼠与鼠之间分别传了6代和13代.荷瘤鼠生存期分别为(38.0±0.9)d和(19.0±1.3)d.肺腺癌脑转移瘤移植瘤不向周围正常鼠脑组织侵袭,分泌酸性粘液及表达癌胚抗原等生物学特征与其亲本肿瘤一致:而GBM移植瘤具有向周围正常鼠脑组织高度侵袭及高表达表皮生长因子受体的生物学特征也与其亲本肿瘤一致. 结论 肿瘤组织块直接注入裸小鼠脑内建立的实验动物模型比肿瘤细胞悬液接种方法 相对简易.且移植瘤能更好地保持亲本肿瘤的特征.此法可进一步在各种腩肿瘤动物原位移植实验中推广应用.     

大鼠脑内C6胶质瘤模型的建立

目的建立稳定可靠的大鼠脑内C6胶质瘤模型。方法取20只健康成年SD大鼠,用立体定向技术将含1×106个C6胶质瘤细胞的悬液15μl缓慢接种于大鼠左侧尾状核区;接种后3周时随机挑选其中10只大鼠麻醉后行MRI检查,观察肿瘤影像学表现,随后处死大鼠取出肿瘤组织,行免疫组化及HE染色检测肿瘤生长情况;另外9只(麻醉死亡1只)大鼠继续饲养直至死亡,观察其生存时间。结果1只接种肿瘤细胞后出现短暂体重下降,但未出现明显神经系统体征,饲养60 d后尸检未见肿瘤生长;其余18只大鼠颅内均有肿瘤生长且无颅外转移现象,病理学检查结果显示脑内肿瘤呈浸润生长,可见新生血管,胶质纤维酸性蛋白表达阳性。荷瘤鼠生存时间为25~47 d,平均(32.78±2.34)d。结论采用立体定向方法向大鼠尾状核区种植C6细胞可获得较为稳定、可靠的胶质瘤动物模型,能够满足胶质瘤动物实验研究的需要。     

U251细胞系来源的脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物模型的建立

目的 从U251细胞系中分离脑肿瘤干细胞并以其为移植物建立动物模型.方法 应用悬浮培养法获得脑肿瘤干细胞,用免疫磁珠分选法分离CD133阳性和阴性细胞;将上述3种细胞植入裸鼠颅内.取移植组织切片观察及进行再培养.结果 免疫磁珠分离技术可获得CD133阳性细胞.悬浮培养法所得的细胞和CD133阳性及阴性细胞进行裸鼠原位移植的成瘤率分别为71.4％、80％和0％.结论 U251细胞系中存在脑肿瘤干细胞.裸鼠颅内注射移植脑肿瘤干细胞能够建立肿瘤模型.     

高侵袭和EGFR过表达的人脑胶质瘤组织异种原位移植模型

目的 建立能向脑组织侵袭和过表达表皮生长因子受体(EGFR)的人脑胶质瘤裸小鼠原位移植模型.方法 首先将体外培养高表达EGFR的人脑多形性胶质母细胞瘤细胞行裸小鼠右尾状核接种,继而将致瘤的组织块行鼠到鼠的原位传代接种.结果 鼠-鼠原位传代接种至13代,生存期为(19±1.33)d.移植瘤病理符合高侵袭、高表达EGFR的多形性胶质母细胞瘤.肿瘤增殖潜伏期短于3d,快速增殖期长于15d,晚期短于3d.结论 肿瘤组织块接种比单细胞悬液接种、非但接种的细胞量大,还能将支持肿瘤细胞增殖的间质成分一并植入,有利于移植瘤保持亲本肿瘤的高侵袭、高表达EGFR的特征.     

Models for neuro-oncological preclinical studies: solid orthotopic and heterotopic grafts of human gliomas into nude mice

To study the optimum therapeutic modalities for treating human malignant brain tumors in vivo without ethical limitations, a model of heterotopic and another of orthotopic xenografting into nude mice were developed. For the first implantation, 11 human high-grade gliomas and 4 low-grade tumors were microsurgically grafted on epigastric vessels. The 11 high-grade gliomas, but no low-grade tumors, were established into nude mice. Afterwards, all these mouse-adapted gliomas which grafted into other nude mice developed. Introduction of a microcatheter into the femoral artery or vein permitted infusion for magnetic resonance imaging (MRI) and treatment. A bladder catheter setting and electrode implantation allowed urine sampling and ECG or EEG recording. Thus, the most important parameters of chemo- and radiotherapy to destroy a maximum number of malignant cells or to inhibit their divisions and the hosts reactions to treatment can be studied. The human gliomas transplanted onto the mouse brain infiltrated the host brain at great distances from the tumor, as in human patients. So, this second implantation constitutes a representative model of the evolution of human gliomas, and allows the study of malignant cell migration in the brain before, during and after treatment determined with the heterotopic model and to appreciate the tolerance of the colonized brain to these treatments. Echography and MRI allowed us to follow the macroscopic evolution with or without treatment of the malignant brain tumors transplanted onto mouse brains. It should now be possible to undertake the same clinical studies on patients after appropriate consideration of ethical and scientific constraints.     

裸鼠原位和异位脑肿瘤生物发光信号成像实验研究

目的应用生物发光成像技术,非侵入性地连续检测活体裸鼠原位和异位脑肿瘤发展演进过程。方法用SMPU-R-MND-luc载体转染人脑肿瘤U87MG细胞系,形成具有高荧光素酶活性的细胞克隆。在裸鼠脑内和胁腰部皮下植入持续表达荧光素酶的肿瘤细胞,建立原位和异位脑肿瘤模型,用影像学资料显示肿瘤部位。用光子发射定量分析动态监测肿瘤生长情况。结果成功地建立了表达荧光素酶活性的原位和异位脑肿瘤动物模型。采集反映肿瘤生长的生物发光信号,肿瘤细胞植入后不同时间点的发光信号值呈显著正相关,而且原位和异位脑肿瘤间存在明显差异。但生物发光脑肿瘤生物发光信号值在第4 d和第14 d时无显著差异。结论体内生物发光成像可以非侵入性地动态检测活体内脑肿瘤演进过程,为研究肿瘤发展机制及最佳治疗策略的选择提供了新的手段和工具。     

Single doublecortin gene therapy significantly reduces glioma tumor volume

We employed lentivirus‐based doublecortin (DCX), as a glioma suppressor gene therapy in an intracranial glioma tumor xenograft model in nude rats. Single DCX‐expressing lentivirus was directly administered into the tumor on day 8 after U87 tumor cell implantation. DCX treatment significantly reduced U87 glioma tumor volume (～60%) on day 14 after DCX lentivirus injection and significantly improved median survival of tumor‐bearing nude rats. DCX synthesis induced neuronal markers MAP2, TUJ1, and PSA‐NCAM and the glial marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the implanted U87 glioma tumors. DCX synthesis induced GFAP that colocalized with tubulin in the mitotic stage, inhibited cleavage furrow during cytokinesis, and blocked mitosis in glioma cells. DCX lentivirus infection did not induce apoptosis but significantly inhibited expression of the proliferation marker Ki‐67 and the blood vessel marker von‐Willebrand factor (vWF). U87 and other glioma cells except for brain tumor stem cells (BTSCs) do not express neuronal markers or both neuronal and glial markers. DCX‐synthesizing glioma cells express a phenotype of antiangiogenic BTSC‐like cells with terminal differentiation that causes remission of glioma cells by blocking mitosis via a novel DCX/GFAP pathway. Direct local delivery of lentivirus‐based DCX gene therapy is a potential differentiation‐based therapeutic approach for the treatment of glioma. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

人脑恶性胶质细胞瘤组织裸小鼠原位移植模型的建立

目的 建立人脑间变性星形细胞瘤的裸小鼠原位移植模型,并探讨移植瘤细胞的生长状况.方法 将表达表皮生长因子受体(EGFR)的新鲜人脑间变性星形细胞瘤的手术标本移植于裸小鼠右尾状核并传代,观察各代移植瘤的生长特性及组织学特点.结果 移植瘤在裸小鼠右尾状核已连续传至7代,向周围鼠脑侵袭性生长;瘤细胞排列紊乱,核大深染且异型明显;移植瘤中EGFR的表达率为70%.结论 本法建它的人脑间变性星形细胞瘤的原位模型能够真实地模拟其原发脑肿瘤的生物学特性,为进一步对间变性星形细胞瘤的放、化疗等实验研究提供可靠的动物模型.     

多聚凝胶介导IGF-IR反义寡核苷酸治疗体内胶质瘤的实验研究

目的探讨反义寡核苷酸阻断IGF-IR基因表达对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用。方法首先建立胶质瘤裸鼠移植模型,随机分为4组:空白对照组、多聚凝胶组、正义核酸组和反义核酸组,反义核酸组在瘤内注射多聚凝胶包裹的反义寡核苷酸,其他每组均作相应的瘤内注射处理。利用多聚凝胶缓释反义寡核苷酸的作用,观察肿瘤的抑制情况、肿瘤病理和IGF-IR表达结果。结果反义核酸组用反义核苷酸开始治疗后的第1周、第2周和第3周,肿瘤的生长速度明显减慢,与空白对照组相比,抑制率分别为65.2%、76.38%和69.6%;而多聚凝胶组和正义核酸组肿瘤生长速度与空白对照组相比无明显差异,其抑制率在各时间点均低于10%。肿瘤的组织病理发现多聚凝胶组、正义核酸组如同空白对照组(野生型),肿瘤细胞密集分布,呈明显的恶性增殖表现,而反义核酸组肿瘤细胞稀疏,可见部分细胞呈凋亡改变,细胞染色质浓聚边缘化。在空白对照组(野生型)、多聚凝胶组和正义核酸组IGF-IR蛋白均呈高表达,而反义核酸组IGF-IR的表达明显减弱。结论IGF-IR的反义寡核苷酸对体内胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,并能诱导部分肿瘤细胞凋亡。因此,IGF-IR可作为胶质瘤基因治疗的靶。     

HIF-1α和hTERT shRNA双基因抑制脑胶质瘤生长的实验研究

目的 研究靶向缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA),对裸鼠皮下人脑胶质瘤中HIF-1α、hTERT基因表达的抑制作用,及其对肿瘤增殖和细胞凋亡的影响.方法 体外培养人脑胶质瘤U251细胞;建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型;将HIF-1α shRNA、hTERT shRNA质粒转染入移植瘤中,观察肿瘤生长情况;HE染色法观察肿瘤组织的病理改变;Western blot检测HIF-1α、hTERT蛋白表达;Annexin V+PI双染流式细胞仪检测凋亡情况.结果 成功建立稳定的裸鼠U251皮下移植瘤模型;治疗5周后HIF-1α shRNA、hTERT shRNA组双基因干扰组肿瘤体积较单基因干扰组及对照组明显减小,抑瘤率为84.2%;病理结果显示双基因干扰组肿瘤生长受到抑制,微血管散在稀疏,大量肿瘤细胞坏死及凋亡;Western blot显示治疗组相应蛋白表达受抑制,双基因干扰组影响二者表达;流式细胞仪检测双基因干扰组肿瘤细胞凋亡率明显高于其他组(P＜0.01).结论 HIF-1α shRNA和hTERT shRNA均可在裸鼠移植瘤体内抑制相应蛋白表达及胶质瘤增殖生长,促进细胞凋亡,而双基因干扰作用更强.