人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

登革病毒衣壳蛋白与葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法：利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体pLEX，转化大肠杆茵G1724并以色氨酸诱导表达，用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定表达的融合蛋白，采用TDA显色法检测融合蛋白中SN的活性。结果与结论：成功构建重组表达载体pLEX-CSN并在大肠杆菌中获得表达，表达的融合蛋白相对分子质量约27000，可被抗登革病毒C蛋白抗体识别，并具有SN的生物活性。为探讨登革病毒衣壳蛋白靶向性抗病毒作用奠定了基础。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化

目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，构建重组克隆载体pGEM-T／L32和表达载体L32-pQE32，转化受体茵E.coli DH5α和E．coli M15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。结果：扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因，LipL32基因插入pQE32表达载体，表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子质量约为31000，与预期大小一致。Western印迹显示能与钩体抗血清特异结合。结论：LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白，重组LipL32蛋白具有结合活性。     

肥胖基因的表达及其表达产物

1978年Coleman等人在C57BL/6J ob/ob突变肥胖小鼠和正常的野生小鼠之间进行交叉循环灌流,肥胖小鼠体重下降和饮食减少,表明肥胖小鼠缺乏一种血源性因子,Coleman最初建议这种血源性因子叫调节因子.并认为是一种激素.同时提出了肥胖基因(obese gene ob)与这血源性因子的产生有关的假设.1994年Zhang等人发现肥胖基因后,才发现了ob基因的表达产物-肥胖蛋     

正常人前列腺组织PSP mRNA的表达

用ＲＴ－ＰＣＲ和ｃＤＮＡ序列测定法分析５名正常中国人前列腺组织中前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ）ｍＲＮＡ的表达。结果表明,在这５名正常前列腺组织中均同是存在ＰＳＰ９４和ＰＳＰ５７ｃＤＮＡ,且基因序列与文献报道的从前列腺癌和增生前列腺组织中获得的完全一致。这可能对ＰＳＰ进一步的基础研究和应用有一定的意义     

登革2型病毒NS5蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的 :构建登革 2型病毒 (DEN_2 )NS5表达体系 ,摸索适宜的诱导表达条件 ,克服大分子蛋白难以表达的瓶颈 ,获得DEN2_2NS5 (相对分子质量 10 4× 10 3)表达产物 ,为以后对其活性、抑制剂等方面的研究奠定基础。方法 :自DEN_2感染组织提取总RNA ,RT_PCR扩增NS5基因片段 (2 .7kb) ,插入质粒pQE30 ,转化XL1Blue大肠杆菌得表达菌株XL1Blue QENS5。同时优化诱导表达和目的蛋白的纯化条件。结果 :表达菌株XL1Blue QENS5增菌培养后更换新的培养基 ,在一定温度范围条件下诱导可以表达出最高占菌体总蛋白 2 2 .8%的NS5蛋白 ,在较低温度下诱导目的蛋白能以可溶性形式表达 ,经过纯化后的NS5蛋白纯度可达 90 %以上。结论 :在国内首次实现了DEN_2NS5蛋白的表达 ,获得的诱导表达条件可能对于其他大分子蛋白的表达有一定的借鉴意义。     

骨基质蛋白基因在骨折愈合过程中的表达

骨基质蛋白基因在骨折愈合过程中的表达史炜镔柴本甫在整个骨折愈合过程中，不断有新的细胞外基质蛋白合成，这些蛋白被认为对骨折愈合具有重要的调控作用。现就目前骨折愈合过程中有关细胞外基质蛋白ｍＲＮＡ表达变化方面的研究作一综述，通过对这种骨（软骨）源系细胞表...     

无POU域八聚体结合蛋白基因的克隆及其在Hepa1-6细胞内的表达

目的构建小鼠无POU域八聚体结合蛋白(non-POU-domain-containing,octamer binding protein,NonO)真核表达载体并在小鼠Hepa 1-6肝癌细胞内表达,观察NonO胞内表达、定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠NonO基因的蛋白编码序列。采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察NonO的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见NonO在Hepa 1-6细胞内表达、分布于细胞核,LPS刺激后NonO分布无明显变化。结论成功构建NonO真核表达载体,为研究NonO在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体。进一步证实NonO为定位于细胞核的核蛋白。     

放疗前后喉癌组织中Bcl-2及Bax蛋白表达及其临床意义

目的　探讨放疗对喉癌组织中Bcl 2和Bax基因蛋白表达的影响及放疗后喉癌复发原因。方法　通过采用免疫组化SP法 ,测定 2 7例患者放疗前、放疗后和复发后喉癌组织中Bcl 2和Bax蛋白的表达。结果　与放疗前相比 ,放疗后喉癌组织中Bcl 2蛋白表达明显减少 (P <0 0 1) ,Bax蛋白表达明显增多 (P <0 0 5 )。喉癌放疗后局部组织中Bax蛋白表达与复发的时间长短有关 (P <0 0 5 )。结论　喉癌组织内Bcl 2和Bax蛋白表达参与了放疗引起的细胞凋亡过程 ,局部组织内Bax蛋白的表达水平与喉癌复发时间有关     

COX-1在卵巢癌组织中的表达及其意义

目的探讨环氧化酶-1（COX-1）在卵巢癌组织中的表达及其意义。方法应用免疫组化SP法检测37例卵巢癌和31例卵巢囊肿组织中COX-1和CA125蛋白的表达;应用ELISA法检测40例卵巢癌和31例卵巢囊肿以及60例正常体检者血清中COX-1和CA125的浓度。结果COX-1、CA125在卵巢癌组织的表达率分别为78%和57%,在卵巢囊肿的阳性表达率仅为7%和3%;卵巢癌患者血清COX-1、CA125的阳性率分别为65%和93%。结论COX-1蛋白表达可作为卵巢癌的辅助诊断指标。     

辐射诱导表达载体pEgr-p16的构建及其体外蛋白表达的研究

目的构建辐射诱导表达载体pEgr—p16并研究其体外稳定转染联合^60Co．γ射线照射对人宫颈癌HeLa细胞p16蛋白表达变化的影响。方法利用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期生长反应因子Egr-1和p16的pEgr—p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导入人HeLa细胞，采用免疫细胞化学和流式细胞术的方法检测照射转染后的HeLa细胞p16蛋白表达的变化。结果经全自动测序证明辐射诱导表达载体pEgr—p16构建正确；稳定转染可见有明显的p16表达增强；5Gy以内p16蛋白表达呈剂量依赖性的增加，在2Gy照射后2hp16蛋白表达水平即开始增高，4h达到最高，12h趋于正常水平。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-p16，在HeLa细胞中蛋白表达明显增强。     

癌基因P^53、H－ras、C－myc蛋白产物在胃癌裸鼠移植瘤中的表达及相互关系

目的：观察癌基因P^53、H－ras、C－myc蛋白产物在不同分化程度胃癌裸鼠移植瘤组织中的表达及相互关系。方法：在建立不同细胞株胃癌裸鼠移植瘤的基础上,用ABC免疫酶标法研究癌基因P^53、H－ras、C－myc蛋白产物在胃癌裸鼠移植瘤中的表达。结果：癌基因P^53、H－ras、C－myc在胃癌裸鼠移植瘤中的阳性表达率分别为50．00％、54．54％、63．63％。P^53阳性表达与移植瘤分化程度有关,即分化越差,其阳性表达越高,P^21、P^62阳性表达与分化程度无关。22例胃癌移植瘤中,有6例显示P^53、P^21、P^62共同阳性,有10例显示P^53与P^21协同表达,有8例显示P^53、P^62协同表达,而无1例单独P^53表达阳性。提示突变型P^53、H－ras、C－myc异常表达与胃癌发生有密切关系。     

电离辐射对小鼠肝脏金属硫蛋白表达的影响

金属硫蛋白（ＭＴ）是一类广泛存在于体内、富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白,具有重金属解毒、调节机体应激反应及必需微量元素代谢等重要功能。重金属、ＩＮＦ、白介素１（ＩＬ１）、白介素６（ＩＬ６）及化学毒物等多种物质均可诱导ＭＴ合成、并产生交叉抗...     

低浓度乙醇诱导与紫外线照射对HepG2细胞周期及p53/p21蛋白表达的影响

目的观察低浓度乙醇诱导与紫外线照射导致HepG2肝癌细胞损伤的分子路径。方法选用HepG2肝癌细胞株，分别给予低浓度乙醇诱导与紫外线照射处理，观察两种损伤因素作用后细胞周期分布的差异，细胞中p53蛋白和p21蛋白表达的改变，分析蛋白表达与细胞周期改变的关系。结果紫外线照射后细胞中p53、p21蛋白表达均明显增强，出现G0～G1／G2～M期阻滞；低浓度乙醇诱导后主要出现G2～M期阻滞与p21蛋白表达的增强，p53蛋白表达改变不明显；两种损伤因素均能导致细胞凋亡率的增加。结论低浓度乙醇诱导与紫外线照射通过激活细胞内不同的分子事件，导致细胞周期与细胞凋亡的改变。     

大鼠脑挫伤后下丘脑c-fos蛋白表达与局部脑血流变化相关性

过去，人们一直认为血管运动中枢只在延髓。而近年越来越多的研究表明，大脑血管调节中枢广泛存在于下丘脑、中脑和延髓。吴思荣等。分别电解毁损家兔双侧下丘脑背内侧核、中脑网状结构和延髓网状结构，发现颅内压和局部脑血流（rCBF）有明显改变。但在脑外伤情况下下丘脯各神经核团对rCBF的凋节尚未见文献报道：笔者用免疫组化方法检测下丘脑各神经核团的C-Fos蛋白表达，了解小同神经核团反应性与血流变化的关系，分析C-Fos表达与rCBF的相关性。     

高迁移率族蛋白B1cDNA的克隆与表达

目的克隆人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）cDNA，构建重组原核表达载体，对其诱导表达并鉴定，为设计HMGB1 cDNA突变体及诱导表达可竞争性抑制HMGB1炎症效应的突变体蛋白奠定基础。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA，经RT-PCR扩增出人HMGB1 cDNA序列，并克隆至载体pUC18进行序列测定，随后构建于原核表达载体pQE-80L中，经IPTG诱导4小时后，可表达Mr约30 000的蛋白。Western Blotting鉴定所表达的目的蛋白。结果经RT—PCR扩增得到了648bp的cDNA，经序列分析与GenBank中报道的已知序列完全一致，构建了HMGB1蛋白的重组表达质粒，诱导表达了目的蛋白，经Western Blotting证实，在Mr约为30000处有一条清楚的蛋白带。结论获得了HMGB1 cDNA的克隆与原核表达载体。     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

新基因XTP11表达蛋白在酵母细胞中的转录激活功能研究

目的 构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP11的酵母表达载体，探索应用酵母双杂交系统克隆与XTP11蛋白结合的肝细胞蛋白的可行性。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增XTP11编码基因，并在其5＇端引入Nco I／BamHI酶切位点，连接入酵母表达载体pGBKT7中，构建编码XTP11全序列与酵母蛋白GAL4 DNA结合域融合蛋白的酵母表达质粒，转化酵母细胞AHl09并应用Westem blot方法检测XTP11蛋白表达。然后铺于含有X-α半乳糖的SD／-Trp和SD／-Trp-His-Ade营养缺陷型培养基上进行自激活验证（蓝／白筛选）。结果 成功地构建了XTP11的酵母表达载体并在酵母细胞中表达相应的融合蛋白，转化了pErBKT7-XTP11的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长，并且可以产生α-半乳糖苷酶，从而在铺有x_n半乳糖的培养基上呈现蓝色，表明XTP11蛋白代替了酵母GALA蛋白的DNA激活域发挥作用，从而激活下游报告基因（ADE2，HIS：3，MEL1和LacZ）的表达。结论 全序列XTP11蛋白与GALA DNA结合域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能，限制了应用酵母双杂交系统研究XTP11的肝细胞结合蛋白。     

细胞间粘附分子重组蛋白的表达与单克隆抗体的制备

细胞间粘附分子 (ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ 1,ＩＣＡＭ 1)是属于免疫球蛋白超家族的一类粘附分子 ,其配体是 β2整合素的两个成员 :ＬＦＡ 1(ＣＤ11ａ/ＣＤ18)和Ｍａｃ 1(ＣＤ11ｂ/ＣＤ18)。ＩＣＡＭ 1与其配体的结合具有重要的免疫学功能 :首先它介导了Ｔ细胞和ＮＫ细胞对靶细胞的杀伤作用 ;其次它还是Ｔ细胞激活的共刺激信号之一 ,在白细胞与血管内皮细胞的粘附中起重要作用 ;另外ＩＣＡＭ 1是鼻病毒的受体 ,还参与肿瘤细胞的转移。ＩＣＡＭ 1已成为抗炎症治疗的重要靶标。本文报道了重组ＩＣＡＭ 1的…     

脊髓型减压病大鼠脊髓组织内NGF和Trk A的蛋白表达

目的 观察大鼠脊髓减压病后脊髓组织内神经生长因子（NGF）及其受体酪氨酸激酶A（Trk A）蛋白表达随疾病进程的变化过程，探讨减压病脊髓损伤后自身的神经保护机制。方法 采用1.0MPa暴露5.5min后极快速减压的方法制备SD大鼠脊髓减压病模型，在出舱0，6，24，48，72h应用免疫组织化学染色和半定量图象分析方法检测脊髓组织NGF及其受体Trk A的蛋白表达。结果 极快速减压后6h开始有少量NGF和Trk A蛋白表达，在24h表达明显增强并达到高峰，此后Trk A表达逐渐减弱，NGF表达直到72h仍比基础值明显增加。结论减压病脊髓损伤诱导了脊髓神经元和胶质细胞的NGF及其受体的合成，提示脊髓型减压病在损伤神经组织的同时也激活了自身的神经保护机制，通过Trk A受体途径NGF可能在保护受损神经细胞中起作用。