辐射诱导表达载体pEgr-p16的构建及其体外蛋白表达的研究

目的构建辐射诱导表达载体pEgr—p16并研究其体外稳定转染联合^60Co．γ射线照射对人宫颈癌HeLa细胞p16蛋白表达变化的影响。方法利用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期生长反应因子Egr-1和p16的pEgr—p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导入人HeLa细胞，采用免疫细胞化学和流式细胞术的方法检测照射转染后的HeLa细胞p16蛋白表达的变化。结果经全自动测序证明辐射诱导表达载体pEgr—p16构建正确；稳定转染可见有明显的p16表达增强；5Gy以内p16蛋白表达呈剂量依赖性的增加，在2Gy照射后2hp16蛋白表达水平即开始增高，4h达到最高，12h趋于正常水平。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-p16，在HeLa细胞中蛋白表达明显增强。     

重组质粒p-Egr-p16的构建及在SMMC-7721细胞中的辐射诱导表达

目的 构建重组质粒p-Egr-p16并探讨在SMMC-772l细胞中的辐射诱导表达及抗肝癌的作用。方法 用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期反应因子Egr—1和p16的p-Egr-p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导人人肝癌SMMC-772l细胞，采用RT-PCR的方法检测了不同剂量^60Coγ射线照射转染后的人肝癌细胞p16基因转录水平的变化和2Gy照射后不同时间的p16基因转录水平的变化。结果经研究证实，1～6Gy照射后p16的转录水平高于对照，在2～4Gy照射后达到峰值，2Gy照射后不同时间均有所增高，在照射后24h增高最明显。结论 2Gy^60Coγ射线照射后p16基因转录水平在2～24h呈现时问依赖性的增高，在24h增高最明显，48和72h逐渐降低，但仍高于对照组。提示^60Coγ射线可激活早期反应生长因子Egr-1，从而介导其下游基因p16的表达增强。     

60Co γ射线对肝癌细胞株HepG2增殖和细胞周期的影响

目的观察^60Coγ射线对肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡和细胞周期的影响，并探讨γ射线对细胞周期改变与p27^kip1蛋白表达和分布之间的关系。方法以不同剂量的γ射线照射培养的HepG2细胞，观察细胞形态和生长曲线变化，同时应用流式细胞计数仪观察细胞周期和凋亡的改变，并应用免疫荧光方法观察p27^dip1蛋白的表达和分布改变。结果^60Coγ射线照射细胞引起HepG2细胞株剂量依赖性的生长抑制和凋亡增加。^60Coγ射线可引起细胞G2／M期阻滞，同时p27^kip1表达明显抑制，并主要分布于细胞浆。结论^60Coγ射线所导致的肝癌细胞株HepG2细胞的G2／M阻滞可能与细胞内D27^kip1“pl的表达抑制和细胞浆的分布比例增加有关。     

~(60)Coγ射线照射诱导人卵巢癌细胞凋亡及细胞周期的改变

目的　探讨6 0 Coγ射线照射对人卵巢癌细胞株A2 780及其顺铂耐药株A2 780 CP体外生长、凋亡及细胞周期的影响。方法　采用四甲基偶唑蓝 (MTT)比色法分析不同辐照剂量 (1～10Gy)对A2 780及A2 780 CP两种细胞株体外生长的影响 ,用流式细胞术 (FCM)比较两者辐照后凋亡及细胞周期的变化。结果　 (1) 1～ 10Gy6 0 Coγ射线照射引起A2 780细胞株明显的生长抑制和凋亡 ,而A2 780 CP细胞则表现出明显的辐照抗性 .(2 ) 6Gy6 0 Coγ射线照射后 6～ 48hA2 780细胞呈现G1 期细胞阻滞和S期细胞比例下降 ,A2 780 CP细胞则呈G1 期细胞比例减少和S期细胞比例增加。结论卵巢癌耐药细胞具有辐射抗性和特征性的细胞周期变化 ,流式细胞术测定辐照诱导肿瘤细胞凋亡及细胞周期的变化可预测恶性肿瘤细胞的辐射敏感性。     

60Coγ射线对大鼠星形胶质瘤细胞增殖抑制作用的机理研究

目的 研究^60Coγ射线对大鼠星形胶质瘤细胞的增殖抑制作用的机制。方法 ^60Coγ射线单次照射，分为对照组、4、16和64Gy组。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长曲线。照射后48h采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布，免疫组化法检测P53及P21蛋白的表达。结果 16和64G主y组C6细胞出现明显的增殖抑制。随着吸收剂量的增大，凋亡比例显著增加（P〈0．01），G0／G1期的细胞比例增加，S期的细胞比例降低。野生型p53与p21随着照射剂量增加，表达增强。P53与P21蛋白表达强度呈正相关，相关系数斜率为0．889。结论 γ射线对大鼠星形胶质瘤细胞系C6细胞的增殖抑制通过诱导细胞凋亡和G1期阻滞实现，G1期阻滞的分子调控通路可能为p53-p21通路。     

60Coγ射线照射诱导人卵巢癌细胞凋亡及细胞周期的改变

目的：探讨^60Coγ射线照射对人卵巢癌细胞株A2780及其顺铂耐药株A2780－CP体外生长、凋亡及细胞周期的影响。方法：采用四甲基偶唑蓝（MTT）比色法分析不同辐照剂量（1－10Gy)对A2780及A2780－CP两种细胞株体外生长的影响,用流式细胞术（FCM）比较两者辐照后凋亡及细胞周期的变化。结果：（1）1－10^60Coγ射线照射引起A2780细胞株明显的生长抑制和凋亡,而A2780－CP细胞则表现出明显的辐照抗性。（2）6Gy ^60Coγ射线照射后6－48hA1780细胞呈现G1期细胞阻滞和S期细胞比较下降,A2780－CP细胞则呈G1期细胞比例减少和S期细胞比例增加。结论卵癌耐药细胞具有辐射抗性和物征性的细胞周期变化,流式细胞术测定辐照诱导肿瘤细胞凋讯及细胞周期的变化可预测恶性肿瘤细胞的辐射敏性。     

中药制剂预防放射性直肠炎37例临床观察

目的 研究野生型p53基因转染卵巢癌SKOV－3细胞对放疗敏感性的影响。方法 用脂质体介导的转染技术，将人野生型p53 cDNA的真核表达重组质粒分别导入受不同剂量放射照射的SKOV－3培养细胞中，观察p53不同状态下对肿瘤细胞放疗敏感性的差异。结果 SKOV－3、SKOV－3－vect及SKOV－3－p53经2Gy照射后，其集落形成数分别下降了18．6％、22．9％及44．5％；经4Gy照射后，其集落形成数分别下降了63．6％、64．9％及88．9％。转染p53基因后，肿瘤细胞S期和G2／M期的比例下降，G1／G0期的比例增加，p53基因的转染使卵巢癌细胞发生G1期阻滞。结论 外源性野生型p53基因的转染，增加了卵巢癌SKOV－3细胞对放疗的敏感性。     

γ射线对培养的兔血管平滑肌细胞的抑制作用

目的 观察体外培养的兔动脉平滑肌细胞(SMCs）对7射线照射的剂量效应关系，探讨电离辐射抑制SMCs增殖的细胞生物学机理。方法 静止期SMCs分别给予γ射线2．5，5，10，20及30Gy一次性照射后继续培养4，24或72h。以^3H—TdR掺入法、流式细胞术分析、微核实验和电镜观察γ射线对SMCs的DNA合成、增殖周期和损伤的影响。结果 在2．5Gy以上剂量γ射线一次性照射时，SMCs增殖明显抑制，细胞G0／G1期阻滞，均呈剂量依赖性。2．5Gy以下剂量γ射线照射后24h左右可见细胞凋亡增加，2．5Gy以上剂量7射线照射可使SMCs发生坏死。结论 电离辐射能抑制SMCs增殖，使细胞产生G0／G1期阻滞，并呈剂量依赖关系。SMCs死亡方式与受照射剂量有关。     

外源表达miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响

目的 研究miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响.方法 采用pre-miR-34a瞬时转染H1299细胞,接受不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基因bcl-2、bax、CDK4、CDK6及cyclinD1的表达水平.结果 不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组各剂量点细胞活力明显降低(t=-2.39、-3.12、-4.98、-4.03、-3.06,P＜0.05),并与阴性对照转染组的差值呈剂量依赖性的增加.6 Gyγ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组细胞凋亡率明显增加(t=7.06,P＜0.05),细胞G0/G1期阻滞(t =3.94,P＜0.05),S期细胞减少(t=6.23,P＜0.05),bcl-2、CDK4及CDK6明显下调(t=3.39、12.88、6.21,P＜0.05),cyclinD1有下降趋势,但差异无统计学意义,而bax明显上调(t=-4.35,P＜0.05),是阴性对照转染组的1.94倍,bcl-2/bax比值下降.结论 miR-34促进H1299细胞凋亡,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞活性,进而提高H1299细胞的辐射敏感性.     

125I粒子持续低剂量率照射对人前列腺癌细胞的抑制作用

目的探讨^125I粒子持续低剂量率照射对人前列腺癌细胞株（PC3）增殖抑制以及对细胞周期的影响。方法^125I粒子（初始剂量率2.77cGy/h）和^60Coγ射线（吸收剂量率2.215Gy/min）对体外培养的PC3细胞进行0、0.5、1、1.5、2、4、6和8Gy照射,用细胞计数、锥虫蓝染色和集落形成法检测细胞增殖、细胞活力和细胞存活率的情况;用单击多靶模型拟合剂量存活曲线;用流式细胞仪检测细胞周期。结果随着照射剂量的增加,^125I粒子照射组的细胞生长比^60Coγ射线组更加明显地受到抑制（P〈0.05）。^125I粒子照射PC3细胞D0值为2.243,Dq为0.87,N为1.618,SF2为0.5。^60Co照射组PC3细胞放射生物学参数D0值为2.824,Dq为1.08,N为1.587,SF2为0.7。^60Co和125I粒子的RBE比值为1.4。与空白对照组相比,^125I粒子组和^60Co组4Gy照射细胞24h后均出现G2期阻滞。结论^125I粒子照射能抑制人前列腺癌细胞的增殖并能使PC3细胞阻滞于G2期。     

大肠癌组织p16蛋白表达与临床病理关系的探讨

 目的研究大肠癌组织p 16蛋白表达及其与临床病理学特征的关系.方法采用免疫组织化学ABC法检测53例大肠癌组织中p 16蛋白的表达.结果大肠癌组织中p 16蛋白表达率为35.8%,p 16表达随肿瘤分化程度的降低而减弱(P＜0.05).Dukes分期,AB期p 16表达率高于CD期,分别为51.5%和10.0%,有显著性差异(P＜0.05).结论p 16蛋白表达缺失与大肠癌发生有关,并可作为临床判断肿瘤分化程度及Dukes分期的重要参考指标.     

肺癌p16、Rb基因mRNA和蛋白水平表达的定位观察

为研究p16和Rb基因在蛋白水平和mRNA水平的表达及其肺癌发生发展的关系,采用免疫组化和原位杂交的方法,对89例肺癌手术标本进行了p16和Rb基因表达的定位观察。发现p16基因蛋白的丢失主要发生于非小 细胞肺癌,Rb基因蛋白的丢失主要发生小于细胞肺癌。两种基因各自在蛋白水平和mRNA水平的表达基本相符。提示p16和Rb基因的表达与肺癌的组织学类型密切相关,有可能作为非小细胞肺癌与小细胞肺癌基因分型诊断的分子生物学指标之一;在翻译水平上也存在着引起基因失活的可能机制。     

p16基因转染对胰腺癌细胞生长及辐射敏感性的研究

目的 探索p16基因转染对胰腺癌细胞生长辐射敏感性的作用。方法 将外源野生型p16基因连接到pCDNA3.1^＋载体构建pCDNA3.16＋ -p16重组质粒,利用Lipofectamine^TM介导转染胰腺癌JF305细胞,筛选阳性克隆。照射后,RT-PCR检测p16基因表达,Western blot检测蛋白表达;用MTT法测定细胞生长曲线和肿瘤细胞杀伤率。结果 转染p16基因的JF305细胞有外源p16基因的整合及表达,生长速度明显减少,对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胰腺癌细胞恶性增殖,提高胰腺癌细胞对辐射的敏感性。     

野生型p16基因体外诱导人瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老的研究

目的：观察野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学效应，探讨对瘢痕疙瘩进行基因治疗的可行性。方法：通过基因转染将含p16 cDNA的真核表达载体pcDNA3-p16导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，筛选出阳性克隆后用测定细胞生长曲线、细胞周期及细胞超微结构等方法观察细胞的变化，用衰老相关-β-半乳糖苷酶染色法鉴定细胞形态。结果：细胞在转染野生型p16基因后自第3代起形态发生明显变化，细胞增殖明显减慢，细胞周期分析显示有96．7％的细胞处于G1期；电镜分析表明，细胞出现明显的溶酶体超载现象。衰老相关-β-半乳糖苷酶染色证实细胞进入衰老期。结论：野生型p16基因可诱导入瘢痕疙瘩成纤维细胞提前进入衰老阶段，这为瘢痕疙瘩基因治疗提供了实验依据。     

p16基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的：探讨p16抑癌基因对涎腺腺样囊性癌（SACC）细胞系增殖的影响。方法：通过脂质体介导的基因转染方法，将p16基因导入涎腺腺样囊性癌细胞系，观察转染组、空载体组和未转染组细胞的生长情况。结果：转染p16基因的细胞系，其细胞生长速度，DNA合成，细胞增殖能力均下降，而未转染组则有相反结果。结论：p16基因能抑制涎腺腺样囊性癌细胞系的增殖。     

p16蛋白在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义

目的探讨p16蛋白在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学的方法(S-P)检测p16蛋白在卵巢子宫内膜异位症及正常子宫内膜组织中的表达。结果 p16蛋白在卵巢子宫内膜异位症中的表达明显低于正常子宫内膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。在卵巢子宫内膜异位症中p16蛋白的表达与痛经、月经异常、不孕无明显关系,而与囊肿大小、异位内膜浸润深度及盆腔浸润情况关系密切,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p16蛋白与卵巢子宫内膜异位症的发生、发展关系密切。     

5-脱氧杂氮胞苷调控p16基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及调亡的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-CdR)对人宫颈癌HeLa细胞增殖和调亡的作用及其可能机制。方法:应用不同浓度的5-Aza-CdR处理HeLa细胞,甲基化特异PCR(MSP)法检测处理前后p16基因甲基化状态,应用RT-PCR方法检测p16基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:人宫颈癌HeLa细胞p16基因启动子区呈高甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。结论:5-Aza-CdR能够逆转p16基因甲基化状态,调控p16基因表达,并有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖和诱导细胞调亡。     

p16基因与头颈部鳞状细胞癌的研究进展

细胞周期受控于周期蛋白与抑制蛋白的相互作用，细胞周期失调导致细胞增殖失控是肿瘤形成的主要原因。p16为细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)的主要抑制因子，是迄今为止所发现的人类第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分。其编码基因是CDKN2A／p16INK4A基因，又名多肿瘤抑制基因，简称p16基因。p16基因在诸多肿瘤中的改变及其抑癌特性，使它成为近年来抑癌基因研究的热点。     

腺病毒介导的p16和p53的联合应用对胆管癌细胞QBC939的生长抑制作用

为研究p16和p53基因的联合应用对胆管癌细胞的作用,将重组体腺病毒p16、p53、p16联合p53转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16、p53基因的表达,细胞的生长抑制及机制进行了分析。RT－PCR显示在胆管癌QBC939细胞系中p16呈低表达,p53不表达,重组体腺病毒能介导p16和p53等外源基因在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,两者联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数证实其能诱导,QBC939细胞发生明显半调并导致其发生G1期阻滞,本研究显示p16及p53基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用,两者联合应用具有协同作用。