阿魏酸钠对肝星状细胞中I型前胶原和CTGF mRNA表达的影响

目的　考察阿魏酸钠对氧化应激条件下 ,肝星状细胞中I型胶原及其相关调控因子CTGFmRNA表达的干预作用。方法　以 5 0 μmol·L-1H2 O2 处理的HSC -T6细胞为氧化应激模型组 ,采用RT -PCR方法检测并分析 12 5 μmol·L-1和 5 0 0 μmol·L-1SF对细胞中I型前胶原及其相关调控因子CTGF表达的影响。结果　肝星状细胞在氧化应激条件下I型前胶原mRNA和CT GFmRNA表达水平都明显上调 ,而阿魏酸钠可以下调二者的表达水平。结论　阿魏酸钠从转录水平调控胶原表达可能对肝纤维化有重要防治作用     

重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞I、Ⅲ型胶原的基因表达

在培养在肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子（hALR）,于不同的时间点收集细胞,提取总RNA,用逆转录定量PCR方法测定I、Ⅲ型胶原的基因表达水平。结果表明,高（0.2ng/L）、中（0.02ng/L）、低(0.002ng/L）浓度的hALR3组肝星状细胞I型胶原基因表达水平在3、24、48、72h4个时间点均明显低于对照组;大剂量组较中、低剂量组I型胶原基因表达水平亦明显为低。中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在24、48、72h3个时间点明显低于对照组;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在8、24、48、72h4个时间点均明显低于对照组,,较中、小剂量组亦显著降低。提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞I、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用。     

乙醛对大鼠HSC增殖以及胶原基因表达影响的实验研究

目的：研究乙醛对新分离的肝星状细胞（hepatic stelalate,cell,HSC）增殖、表达α1（Ⅰ）型胶原mRNA、IkB和NF-kB的影响，以探讨酒清性肝纤维化发病机理。方法：用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度分离培养大鼠肝星状细胞。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、原位杂交法、免疫细胞化学法、凝胶电泳迁移率法（EMSA）分别检测肝星状细胞的增殖、胶原合成、IkBα以及NF－kB的表达。结果：（1）成功分离出大鼠肝星状细胞。（2）乙模型刺激新分离培养的肝星状细胞后细胞明显增殖；乙醛刺激传一代肝星关细胞后，α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达显著增加；IkBα表达明显下降；乙醛作用肝星状细胞后30min，NF－kB的表达即有增加，到120min时达最高值。结论：乙醛可以使静止的肝星状细胞活化，表现为增殖、α1（Ⅰ）型胶原mRNA合成、IkBα表达下降、NF-kB活性增加。     

重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达

在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子(hALR),于不同的时间点收集细胞,提取总RNA,用逆转录定量PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达水平.结果表明,高(0.2ng/L)、中(0.02 ng/L)、低(0.002ng/L)浓度的hALR 3组肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达水平在8、24、48、72h 4个时间点均明显低于对照组;大剂量组较中、低剂量组Ⅰ型胶原基因表达水平亦明显为低.中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在24、48、72h 3个时间点明显低于对照组;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在8、24、48、72h 4个时间点均明显低于对照组,较中、小剂量组亦显著降低. 提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用.     

咖啡酸苯酯对大鼠肝星状细胞增殖和细胞凋亡的影响

目的观察核因子KB(NFKB)抑制剂咖啡酸苯酯(CAPE)在大鼠肝星状细胞(HSCs)增殖,胶原合成和细胞凋亡方面的作用。方法经在体灌流消化大鼠肝脏分离HSCs,培养于DMEM培养基中,用3HTdR和3Hproline掺入试验测定CAPE对HSCs的增殖和胶原合成影响,并用原位杂交方法和TUNEL法探讨了其对HSCⅠ、Ⅲ型前胶原基因的表达和细胞凋亡作用。结果对于培养活化的HSCs,CAPE分别在5、10μmol·L-1时,剂量依赖地抑制HSCs摄取3HTdR和3Hproline,并降低Ⅰ型前胶原基因表达(P<0.05),40μmol·L-1CAPE作用12、24h后,HSCs凋亡指数分别由(2.82±0.73)%和(3.15±0.88)%增加到(7.66±1.25)%和(10.61±2.88)%(P<0.01).结论CAPE降低HSCs增殖和胶原合成,并在较高浓度条件下诱导细胞凋亡。     

复方红景天干预大鼠胶原合成机制的初步探讨

目的：从分子水平初步探讨复方红景天干预大鼠肝纤维化可能的机制，为进一步研究开发红景天制剂提供理论依据。方法：用四氧化碳皮下注射法诱导SD大鼠肝纤维化模型，同时给予复方红景天颗粒口服进行干预性治疗，观察复方红景天对大鼠肝组织TGFβ1、I型前胶原mRNA表达水平的影响。结果：口服复方红景天可能通过抑制大鼠肝组织TGFβ1、I型前胶原mRNA的表达。结论：复方红景天可能通过抑制TGFβ、I型前胶原MRNA表达，从而减少胶原合成等机制有效干预CC14诱导的大鼠肝纤维化，值得深入研究。     

ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Na+/Ca2+泵mRNA表达的研究

目的 :探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞 (HSC)Na /Ca2 泵mRNA表达的影响。方法 :用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用RT PCR测定PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性后Na /Ca2 泵mRNA表达。结果 :乙醛刺激后 ,HSC后明显促进Na /Ca2 泵mRNA表达 (P<0 0 1) ,不同剂量PD980 5 9对肝星状细胞Na /Ca2 泵mRNA表达的影响无统计学意义。结论 :Erk信号传导通路可能对乙醛刺激的肝星状细胞激活状态的启动无明显影响     

类胰蛋白酶对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的观察类胰蛋白酶对肝星状细胞（HSC）增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，探讨类胰蛋白酶在肝纤维化中的作用。方法用Percoll密度梯度离心法分离、培养大鼠HSC，经系列浓度类胰蛋白酶作用后，分组进行如下实验：用噻唑兰比色法（MTT）检测HSC的增殖；用RT—PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果肥大细胞（MC）类胰蛋白酶（1-100ng／m1）能够促进HSC增殖及Ⅰ型胶原mRNA的表达，此作用呈剂量依赖性（各实验组与对照组比较，P〈0．05）。结论肥大细胞类胰蛋白酶可直接作用于HSC，参与肝纤维化过程。     

复方红景天干预大鼠胶原合成机制的初步探讨

目的 从分子水平初步探讨复方红景天干预大鼠肝纤维化可能的机制,为进一步研究开发红景天制剂提供理论依据。方法 用四氯化碳皮下注射法诱导SD大鼠肝纤维化模型,同时给予复方红景天颗粒口服进行干预性治疗,观察复方红景天对大鼠肝组织TGFβ1、Ⅰ型前胶原mRNA表达水平的影响。结果 口服复方红景天可能通过抑制大鼠肝组织TGFβ1、Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结论 复方红景天可能通过抑制TGFβ1、Ⅰ型前胶原MRNA表达,从而减少胶原合成等机制有效干预CCl_4诱导的大鼠肝纤维化,值得深入研究。     

自身免疫性肝炎患者肝组织纤维化机制的研究

目的 探讨自身免疫性肝炎(AIH)肝纤维化的机制。方法 以突触素(SYN)标记36例AIH患者肝穿刺标本的肝星状细胞(HSC)，采用免疫组化方法检测HSC、Ⅰ型胶原(ColD、Ⅳ型胶原(ColⅣ)及膜型基质金属蛋白酶1(MT-MMP-1)的表达，原位分子杂交方法(ISH)检测MT-MMP-1 mRNA及组织型金属蛋白酶1(TIMP-1)mRNA的表达。结果 36例AIH肝组织内SYN阳性HSC主要分布于汇管区、细胞纤维间隔及肝小叶炎症活动部位，尤其活动性界面炎部位往往呈聚集性分布，周围易见胶原纤维沉积，SYN阳性HSC数量与AIH肝组织活动指数(HAl，Knodell)呈正相关关系。ColⅠ、ColⅣ的表达量随AIH肝纤维化程度的增加而增加。ColⅣ主要分布于活动性炎症区域并随塌陷窦壁呈聚集性分布，ColⅠ主要见于纤维间隔及汇管区内，为S5～6期(Knodell)AIH肝组织内主要的细胞外基质(ECM)成分。MT-MMP-1及其mRNA阳性细胞主要见于汇管区周围界面炎及细胞纤维间隔边缘部位间质细胞内，周围少部分肝细胞亦呈阳性表达。MT-MMP-1及其mRNA表达与AIH肝组织HAI密切相关，且随AIH肝纤维化分期而增强，于S4～5期(Knodell)表达量最高，其后有所下降。AIH肝组织内TIMP-1的表达随肝纤维化的进展大致呈递增趋势。结论 AIH免疫损伤致反复持续性活动性炎症引起HSC的大量活化、增殖，进而引起ECM的沉积可能是AIH肝纤维化发生和进展的重要原因之一；MT-MMP-1引起ColⅣ的降解，改变HSC周围的微环境而诱导HSC的激活可能是HSC活化、增殖的机制之一；AIHECM的降解水平相对低下可能是AIH肝纤维化进展的另一重要机制。此外，本实验结果显示，SYN是研究肝纤维化组织内HSC的一个较好的标志物。     

肝再生增强因子抑制肝非实质细胞TGF-β1表达的意义

目的 探讨肝再生增强因子（ALR）促进受损肝细胞增殖的机制。方法 采用免疫组化方法检测ALR对肝星状细胞和Kupffer细胞（KC）中TGF-β1表达的影响，Western blot法检测ALR对肝星状细胞表达TGF-β1的影响，细胞增殖试验（MTT法）观察经ALR刺激的大鼠肝星状细胞条件培养液（ICCM）、KC条件培养液（KCCM＋）对受损肝细胞增殖的影响以及ALR对TGF-β1抑制受损肝细胞增殖的作用。结果 经ALR刺激后肝星状细胞和KC中TGF-β1免疫反应阳性信号减弱，Western blot显示ALR可抑制肝星状细胞表达TGF-β1受损肝细胞经ICCM和KCCM刺激后增殖明显。ALR可拮抗TGF-β1对受损肝细胞增殖的抑制作用。结论 ALR可能通过抑制肝星状细胞和KC表达TGF-β1来促进受损肝细胞增殖。     

IL-1β、TNF-α对大鼠肝星状细胞MMP13基因表达的调节

为了解白介素－1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）对大鼠肝星状细胞间质胶原酶（MMP13）基因表达的影响,在培养的肝星状细胞系中加入IL－1β、TNF-α于不同的时间点收集细胞,提取总RNA,用逆转录定量PCR方法测定MMP13的基因表达水平。结果表明,IL－1β组肝星状细胞MMP13基因表达水平在8,24,48h三个时间点均明显高于对照组,24h达高峰,为对照组的3倍;TNF－α组肝星状细胞MMP13的基因表达水平在8,24,48,72h均明显高于对照组,48h达高峰,为对照组的4倍。上述结果提示IL－1β、TNF-α可增强肝星状细胞MMP13基因的表达。     

长期跑台运动对大鼠跟腱胶原和胰岛素生长因子表达的影响

目的:探讨长期跑台运动对大鼠跟腱胶原含量、胶原I、胶原III及胰岛素生长因子(IGF-I)表达的影响。方法:20只SD雄性大鼠随机分为对照组和运动组。对照组不运动。运动组进行12周跑台运动,速度为20m/min,坡度为10%,每天40min。采用ELISA法测定I型胶原的前胶原氨基末端肽(PINP)I、II型胶原的前胶原氨基末端肽(PIIINP)和IGF-I含量;采用实时荧光定量PCR法测定前胶原Iα1 mRNA、前胶原IIIα1 mRNA和IGF-I mRNA表达水平。结果:与对照组相比,运动组血清IGF-I含量、跟腱PINP和IGF-I含量及前胶原Iα1mRNA和IGF-I mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论:长期跑台运动可以通过提高跟腱胶原I合成量来适应负荷I,GF-I在跟腱对运动的适应中可能有一定作用。     

热应激通过激活NLRP3/IL-1β/IL-6途径介导肝脏炎症损伤效应

目的 探究热应激致肝炎症损伤的分子机制.方法 雌性SD大鼠随机分为对照组和热应激组,38℃暴露建立热应激动物模型,每天暴露2 h,连续3 d,分离肝组织;体外培养的L-02细胞分为对照组、热应激组、热应激+二甲基亚砜(DMSO)组及热应激+白藜芦醇组(100μmol/L),采用5％CO2,41℃暴露建立热应激细胞模型,药物组及溶剂对照组提前给予100μmol/L白藜芦醇或DMSO预处理2 h,再进行热应激暴露,分别收取细胞;以上收取的肝组织及细胞均进行NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)蛋白表达水平及白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 mRNA表达水平检测.结果 ①与对照组相比,热应激可导致肝NLRP3炎症小体的激活,促进caspase-1将IL-1β切割为活性形式,进而导致下游靶基因IL-6的表达上调.敲低L-02细胞中NLRP3表达可显著抑制炎症小体的激活及下游炎症因子级联表达反应的发生;②白藜芦醇可通过抑制NLRP3的表达从而拮抗热应激所致肝细胞炎症因子诱导表达效应.结论 热应激通过NLRP3/IL-1β/IL-6途径诱导肝脏炎症损伤,白藜芦醇能缓解以上炎症损伤反应,在热应激损伤防护中具有潜在应用前景.     

结缔组织生长因子在放射性肝纤维化大鼠中的动态表达及其与肝星状细胞活化的关系

目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在放射性肝纤维化大鼠中的动态表达及其与转化生长因子β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的相关性,了解CTGF与肝星状细胞（HSC）活化的关系。方法：雄性SD二级大鼠40只,用数字表法随机分为模型组（30只）和对照组（10只）。模型组大鼠右半肝接受单次6 MV X射线25 Gy照射,于照射后2、4和6个月,分别用数字表法随机抽取模型组大鼠10只,对照组予以假照射后6个月,均采用HE染色观察肝组织病理变化及大鼠肝纤维化半定量积分,免疫组织化学法、RT-PCR法检测肝组织中CTGF、TGF-β1、α-SMA及其mRNA表达,并对其进行相关性分析。结果：与对照组相比,模型组于照射后2、4和6个月,肝纤维化半定量积分逐渐增加（F=25.82,P<0.05）,模型组大鼠CTGF、TGF-β1、α-SMA蛋白的表达逐渐增多（F=55.44、16.22、121.12,P<0.05）。对照组肝组织中,CTGF、TGF-β1、α-SMA的mRNA仅有少量表达;模型组在照射2、4和6个月CTGF、TGF-β1、α-SMA的 mRNA均逐渐升高（F=177.11、133.85、217.46,P<0.05）。相关性分析表明,大鼠肝组织中CTGF与α-SMA、TGF-β1与α-SMA均存在正相关（r=0.638、0.715,P<0.05）。结论：CTGF的表达随着肝纤维化程度的加重而升高,在放射性肝纤维化过程中CTGF可能参与了激活TGF-β信号通路,从而促进HSC的活化与增殖。     

192Ir血管内放射治疗对血管成形术后I型胶原表达的影响

探讨^192Ir血管内放射治疗对血管成形术后I型胶原表达的影响及其机制。小型猪髂动脉再狭窄模型，成形术后随机分为放疗组（血管数n=6)和对照组（血管数n=18)，分别于术后12周及24周取材进行I型胶原、MMP－1及TIMP－1的免疫组化染色和I型胶原mRNA原位杂交并进行定量研究。结果显示，放疗组I型胶原蛋白、mRNA及TIMP－1／MMP－1比值均低于对照组，对照组I型胶原mRNA表达高峰在24周，而放疗组表达高峰在12周。提示^192Ir血管内放射治疗通过抑制I型胶原的合成和调节MMP－1及TIMP－1的活性而影响血管成形术后细胞外胶原的代谢。     

高血糖对肝纤维化大鼠肝组织α—SMA和CTGF表达的影响

目的探讨高血糖对肝纤维化大鼠肝组织α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA反映肝星状细胞HSC活化）和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法将52只SD雄性大鼠随机分为糖尿病肝纤维化组、正常血糖肝纤维化组与正常对照组。通过链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导糖尿病,后用四氯化碳诱导肝纤维化。肝组织HE染色检测病理改变。免疫组化法检测肝组织α－SMA、CTGT蛋白表达。结果高血糖肝纤维化组α—SMA（灰度值142．5±3．67）和CTGF（灰度值144．2±5．01）表达水平较正常血糖肝纤维化组（α—SMA灰度值158．9±2．18,CTGF灰度值157．7±6．80）显著升高（P〈0．05）。结论高血糖可通过诱导肝脏α—SMA、CTGF表达,加重大鼠肝纤维化的程度,促进肝纤维化的形成。其机制与促进肝星状细胞的增殖活化及细胞外基质的合成分泌等有关。     

酒精性肝纤维化基质降解机制的研究

为揭示酒精性肝病（ALD）肝纤维化基质降解的病理机制，28例ALD肝穿刺组织按其纤维化程度分为3组，应用原位杂交技术分别检测各组肝组织内基质金属蛋白酶－1（MMP－1）、基质金属蛋白酶－2（MMP－2）、膜型基质金属蛋白酶－1（MT1－MMP） mRNA和基质金属蛋白酶抑制酶－1（TIMP－1） mRNA的表达。结果发现，MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA阳性细胞主要位于纤维化的中央静脉、窦周及汇管区等部位周围，且MMP－2和MT1－MMP mRNA的表达细胞有重叠，MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA表达阳性细胞数随肝纤维化程度的加重而增多，而MMP－1 mRNA表达阳性细胞数减少，且以纤维化中期变化为著；MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA表达阳性细胞主要为肝窦壁细胞，少数肝细胞亦呈阳性表达，提示MMP－1养活和TIMP－1增多可能是ALD肝纤维化过程中细胞外基质（ECM）沉积、尤其是Ⅰ型胶原过量沉积的病理机制之一；MMP－2和MT1－MMP在基质降解过程中可能有协同作用，其表达增多可能对ALD时中央静脉纤维化、肝窦血管化起一定促进作用；肝窦壁细胞（肝星状细胞等）为肝组织内MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1的主要产生细胞。     

TGFβ1正、反义基因转染60Co照射HELF对TGFβ1及I型前胶原mRNA表达调控影响

目的 观察TGFβ1正、反义基因转染^60Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1、mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法 采用脂质体介导法进行基因稳定转染,转染细胞经PCR,DNA dot blot鉴定和RNA dot blot分析。结果 选择5Gy照射细胞,采用Lipofect AMINEuqf TGFβ1正、反义基因表达载体pMAM-TTGFβ1pMAMneo-AntiTGFβ1转入HELF,转染细胞经G418抗性筛选出来,在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性,且可用neo基因转导的PCR引物扩增出276bp的阳性片段。对提取的RNA地高辛标记的TGFβ1探针和α1（Ⅰ）寡核苷酸探针经RNA dot blot分析表明,转染pMAMneo-AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1 mRNA水平下降,而转染pMAMneo-TGFβ1的细胞其TGFβ1 mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA,前者表达水平比未转染细胞低,后者则略高。结论 TGFβ1反义基因转染^60Co γ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1 mRNA含量水平减少,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低。     

TGFβ1正、反义基因转染60Co照射HELF对TGFβ1及I型前胶原mRNA表达调控影响

目的　观察TGFβ1正、反义基因转染6 0 Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法　采用脂质体介导法进行基因稳定转染 ,转染细胞经PCR ,DNAdotblot鉴定和RNAdotblot分析。结果　选择 5Gy照射细胞 ,采用LipofectAMINE将TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo TGFβ1和pMAMneo AntiTGFβ1转入HELF ,转染细胞经G418抗性筛选出来 ,并且在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA ,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性 ,且可用neo基因特异的PCR引物扩增出 2 76bp的阳性片段。对提取的RNA用地高辛标记的TGFβ1探针和α1(Ⅰ )寡核苷酸探针经RNAdotblot分析表明 ,转染pMAMneo AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平下降 ,而转染pMAMneo TGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA ,前者表达水平比未转染细胞低 ,后者则略高。 结论　TGFβ1反义基因转染6 0 Coγ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1mRNA含量水平减少 ,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低