AdEasy1／Cbfa1诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的：观察核心结合因子a1（Cbfa1）对兔骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的诱导作用。方法：体外分离培养兔骨髓MSCs，用AdEasy1／Cbfa1。转染MSCs，在转染后3d,1、2、3和4周时，组织化学和免疫组化等方法检测成骨标志碱性磷酸酶和骨钙素的表达。结果：AdEasy1／Cbfa1转染后的兔骨髓MSCs表现出与成骨细胞相似的形态，并且表达碱性磷酸酶和骨钙素。结论：Cbfa1可诱导兔骨髓MSCs向成骨细胞分化。     

AdEasy1/Cbfα1诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的观察核心结合因子α1(Cbfα1)对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化的诱导作用.方法体外分离培养兔骨髓MSCs,用AdEasy1/Cbfα1转染MSCs,在转染后3 d、1、2、3和4周时,组织化学和免疫组化等方法检测成骨标志碱性磷酸酶和骨钙素的表达.结果AdEasy1/ Cbfα1转染后的兔骨髓MSCs表现出与成骨细胞相似的形态,并且表达碱性磷酸酶和骨钙素.结论Cbfα1可诱导兔骨髓MSCs向成骨细胞分化.     

脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展

骨髓是间充质干细胞的丰富来源,但是关于脐血及循环血中是否存在MSC,在研究初期一直存在争议。2000年,Erices等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞,其表达SH1,SH2等间充质细胞标志抗原,并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞,其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似,同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。有研究者证明,脐带血中含有间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并且具有多向分化潜能和很高的可塑性。     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

鼠间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的研究

目的:探讨干细胞向成骨细胞诱导分化的特征。方法:利用成骨细胞诱导体系诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)向成骨细胞定向分化,D1细胞诱导不同时间后,运用免疫组化方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL1)的表达;RT-PCR检测Osterx和OCN mRNA的表达。结果:细胞诱导培养3、7、14和21 d后结果显示:3 d时ALP、COL1呈阴性表达,7 d ALP呈阳性表达,14 d ALP表达最高,21 d ALP表达明显减少;7 d COL1呈阳性表达,14 d和21 d表达显著增强;14 d有矿化结节形成,21 d形成典型的矿化结节。7 d时OSX和OCN基因表达上调,14 d时OSX基因表达下调,21 d其表达上调;14 d时OCN表达上调,21 d后表达下调。结论:间充质干细胞能定向诱导为成骨细胞,OSX基因的表达是其分化的关键。     

重组腺病毒介导noggin诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化

目的 探讨体外分离、培养大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法 ,采用重组腺病毒介导的noggin基因体外诱导方法 ,观察MSCs向神经细胞的定向分化效应.方法 原代培养MSCs 24h开始贴壁,呈梭形,集落样生长,纯化后,采用含noggin基因的重组腺病毒(pAdEasy-1-noggin)感染原代培养的MSCs,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用鉴定神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核抗原(NeuN)、神经丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫细胞化学方法 对诱导后的细胞进行鉴定.结果 倒置显微镜下观察可见,MSCs经重组腺病毒感染后48h,细胞向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NeuN和NF-200,而GFAP表达阴性.结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;noggin基因重组腺病毒载体可成功诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

人骨髓间充质干细胞定向成骨诱导中碱性磷酸酶对其成骨能力的影响

目的 探讨定向诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)分化为成骨细胞过程中,碱性磷酸酶(ALP)对hBMSCs成骨能力的影响. 方法抽取骨髓,梯度离心法分离单个核细胞,在DMEM条件培养基诱导hBMSCs定向分化为成骨细胞;相差显微镜观察成骨细胞形态,MTT法检测成骨细胞增殖,测定成骨细胞ALP分泌量及成骨细胞胞内ALP含量,RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA的表达. 结果梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的hBMSCs;体外定向诱导过程中,成骨细胞ALP含量和ALP mRNA的表达在定向诱导10 d左右开始显著升高,成骨细胞的增殖能力明显增强.随着传代次数的增加,成骨细胞的增殖能力和碱性磷酸酶分泌量以及ALP mRNA的表达呈下降趋势,与BM-Purple染色结果一致. 结论 hBMSCs经定向诱导后可以分化为成骨细胞,ALP含量的变化能够显著影响hBMSCs诱导成骨的能力.     

间充质干细胞的来源及临床应用

在骨髓中存在着一群非造血的干细胞成分———间充质干细胞。间充质干细胞在体外可扩增 ,在体内体外都能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞和支持造血的基质等。间充质干细胞是多潜能 ,并且易分离培养 ,在体外可被大量扩增。因此 ,间充质干细胞在组织工程、细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。本文对骨髓来源的间充质干细胞的生物学特性和其他间质组织来源的间充质干细胞以及它们在临床上的应用进行了综述     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

人脐带组织间充质干细胞研究进展及应用前景

近年来对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究越来越多,MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肾和各种胎儿组织中提取,并能横向分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等不同胚层的细胞。人脐带组织间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,与其他来源的MSCs相比,具有来源广泛,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点。本文就其生物学特征、优势以及临床应用前景等予以综述。     

间充质干细胞促进半相合骨髓移植治疗急性放射病小鼠的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)促进半相合造血干细胞移植(haploid-SCT)治疗急性放射病小鼠的作用及机制。方法 ⁶⁰Co γ射线照射BALB/C(H-2^d)雌性小鼠8Gy,单独输注半相合CB6F1(H-2 bd) 雄性小鼠骨髓细胞1×10⁹/kg(I组),或联合CB6F1 雌性小鼠MSCs不同数量级1.5×10⁸/kg (a组)、5×10⁷/kg (b组)和2.5×10⁷/kg (c组)治疗,比较放射病小鼠的生存分析。同时,MSCs组小鼠尾静脉输注经cm-DiI膜染剂标记的CB6F1雌性小鼠MSCs和CB6F1雄性小鼠的骨髓细胞,与只输注CB6F1骨髓细胞的对照组比较,观察移植后不同时间供者细胞在受者骨髓的植入率、供者MSCs在受者体内发布、外周血象、T淋巴细胞亚群、胸骨骨髓病理和慢性移植物抗宿主病(GVHD)发生情况。结果 a组小鼠早期死亡率增加;b和c组存活率高于I组(P<0.05),但二组之间差异无统计学意义。移植后30 d,MSCs组受者骨髓的sry基因高于对照组。移植后MSCs主要集中在胸腺、骨髓、肝和小肠中,有形态改变。MSCs组的白细胞、血小板恢复较快。照射后15和30 d,MSCs组小鼠骨髓腔中的巨核细胞明显高于对照组。移植后7、14和30 d,MSCs组CD3高于对照组(P<0.05);移植后14和30 d,MSCs组CD4阳性细胞率和CD4/CD8值高于对照组(P<0.05)。MSC组慢性GVHD症状出现较对照组晚30 d。结论 MSCs通过促进干细胞植入,改善造血微环境,促进造血恢复,加快T淋巴细胞的恢复,延缓GVHD的发生时间和促进放射损伤的组织器官的修复,加强了半相合骨髓移植对急性放射病的治疗作用。     

直接接触共培养技术在体外探索细胞间相互作用的应用研究

目的:建立观察直接接触共培养体系中单一种类细胞生长变化的研究方法,探索直接接触共培养技术在体外细胞之间相互作用研究中的应用。方法:大鼠软骨细胞与荧光标记的大鼠骨髓间充质干细胞以1∶2的比例平面共培养7天。共培养2天时,应用共聚焦显微镜观测共培养体系中两种细胞的增殖情况;共培养7天时,应用流式分选技术分选出单一种类细胞,然后分析其成软骨分化特异性基因的表达。结果:经过共培养后,骨髓间充质干细胞比例减少;共培养组中软骨细胞增殖率高于单独培养组;在共培养体系中骨髓间充质干细胞的成软骨分化趋势明显,但软骨细胞成软骨分化特异性基因表达下降。结论:本实验应用流式细胞术以及共聚焦显微镜技术成功检测了直接接触共培养体系中骨髓间充质干细胞和软骨细胞各自的细胞增殖与成软骨分化特异性基因的表达,明确了直接接触共培养技术可以有效地应用于体外细胞间相互作用的研究。     

异位骨化的实验研究现状

异位骨化（HO）以骨骼系统外骨形成为特点。有关创伤引起的HO的实验进展报道较多。某些特定细胞能诱导HO,它们分泌骨形态发生蛋白（BMP）诱导受体间充质细胞向软骨和骨组织分化。BMP不同亚型诱导HO能力不同,联合应用更有效。近年发现BMP基因可能与HO关系密切。受到关注的还有Msx2、c-fox等基因。     

人诱导多能干细胞体外多向分化能力的方法验证

 目的 探讨人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)体外多向分化能力的方法。方法 iPSC通过形成拟胚体(embryonic body, EB)的阶段,将其诱导为间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)样细胞,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化,流式细胞术检测iPSC来源的MSCs(iPS-MSCs)表面标志物的表达,并进一步将iPSC-MSC诱导为成骨、软骨细胞;或直接EB接种,将其诱导成神经细胞。通过上述方法验证iPSC的多向分化能力。结果 诱导后的 iPSC-MSC 逐渐向外生长变为长梭形; CD29、CD105在 iPSC -MSCs 中表达阳性, 而 CD34、CD45则为阴性; 碱性磷酸酶、甲苯氨兰染色结果表明iPSC -MSCs 具有成骨、成软骨的能力;iPSC亦可直接从EB阶段诱导成神经细胞。结论 通过上述方法,可成功诱导iPSC 为成骨、成软骨、成神经细胞,为 iPSC进一步的研究与应用提供了技术基础。     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

成骨细胞促进急性放射损伤小鼠骨髓造血系统及血管恢复的研究

目的 探讨成骨细胞对放射损伤小鼠骨髓造血系统及血管恢复的影响.方法 取18只雄性BALB/c小鼠股骨制备成骨细胞,其余42只小鼠随机分成健康对照组、成骨细胞组和生理盐水组3组.健康对照组不做任何处理;成骨细胞组和生理盐水组小鼠于6.0 Gy 60 Co γ射线一次性全身均匀照射后,分别经尾静脉输入成骨细胞(2×106个/只)和等体积的生理盐水.于照射后第7、14和21天计数小鼠外周血细胞,骨髓单个核细胞并作骨髓组织学观察.采用流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+细胞百分比,采用免疫组织化学方法检测小鼠骨髓微血管密度.结果 照射后第7、14和21天成骨细胞组小鼠外周血细胞和骨髓单个核细胞计数,骨髓单个核细胞中CD34+细胞百分比,骨髓组织造血面积及骨髓微血管密度均明显高于生理盐水组(t=2.46～64.51,P＜0.05).结论 成骨细胞能促进放射损伤小鼠骨髓造血系统及血管的恢复.

Abstract：

Objective To explore the effects of osteoblasts on the recovery of hematopoiesis and angiogenesis in acute irradiation injury mice.Methods The femurs of 18 male BALB/c mice were used to prepare the bone marrow osteoblasts, and the rest mice were divided into 3 groups as normal group, saline group and osteoblast group.The mice in normal group received no treatment, and the other two groups were received 6.0 Gy 60Co γ-ray irradiation.After irradiation each mouse of osteoblast group was administered with 2 × 106 osteoblasts through tail vein injection, and equal volume saline was given to each mouse of saline group by the same way.The following factors were measured at 7, 14, 21 d after irradiation, they were the counts of peripheral blood cells and bone marrow mononuclear cells ( BMMNC ) , the percentage of CD34 + cells in BMMNC, the histology changes and micro vascular density (MVD) of bone marrow tissue.Results The counts of peripheral blood cells, BMMNC and hematopoietic tissue area in osteoblast group were higher than those in saline group.The percentage of CD34 + cells in BMMNC and the MVD of bone marrow in osteoblast group were also higher than those in saline group at 7, 14, 21 d after irradiation ( t = 2.46 - 64.51, P ＜ 0.05 ).Conclusions Osteoblasts could significantly promote the recovery of hematopoiesis and angiogenesis in mice after acute irradiation injury.     

不同细胞移植修复兔全层关节软骨缺损的比较研究

目的 :比较软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞对全层关节软骨缺损的修复作用。材料和方法 :取幼兔的软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞 ,共 3种有生成软骨潜力的细胞进行体外分离培养 ;以聚乳酸 (PLA)为载体 ,将培养的原代细胞植入PLA支架上 ,形成细胞 -PLA复合物。于 2 8只成年新西兰大白兔的股骨滑车关节面上造成直径 4 5mm、深 3 0mm的全层关节软骨缺损 ,将 3种细胞 -PLA复合物分别植入关节软骨缺损处。植入细胞 -PLA复合物为实验组 ,单纯植入PLA支架为对照组。术后 6周、12周观察缺损修复情况及新生组织类型。结果 :软骨细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨部分重建 ;细胞排列紊乱。骨髓基质细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界不明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨重建良好 ,软骨下潮线恢复 ;细胞排列趋于正常。成纤维细胞移植组为纤维组织修复 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阴性 ;软骨下潮线消失。对照组为纤维组织修复。结论 :软骨细胞、骨髓基质细胞移植修复软骨缺损明显优于成纤维细胞及对照组。骨髓基质细胞与软骨细胞移植组的修复结果无统计学差异 ,但骨髓基质细胞修复组织的细胞排列有序 ,软骨下骨重建良好 ,与周围组织融合密切 ,更接近正?