金刚烷胺衍生物的合成和生物活性

为了寻找新的神经元保护剂，合成了7个新的1位氮取代的金刚烷胺类衍生物，其结构均经核磁共振氢谱(¹H NMR)、MS-FAB和高分辨质谱(HRMS)确证；以四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定法初步考察了所合成化合物体外对谷氨酸损伤神经细胞的保护作用，研究显示，500 μmol·L^-1谷氨酸能够引起神经元细胞发生明显的损伤性变化，细胞死亡率升高，MTT值明显降低，LDH漏出率增加；加入一定浓度的化合物能够显著提高谷氨酸损伤的人神经母细胞瘤株SY5Y的MTT代谢率，降低细胞死亡率，而且进一步研究显示化合物3d和4c能显著降低LDH漏出率，对谷氨酸损伤的神经细胞体外模型显示了保护作用。     

Ebselen对自由基诱发的皮层神经元和皮层线粒体脂质过氧化损伤的保护作用

观察了ebselen对超氧阴离子O^·-₂和羟自由基·OH诱发的体外培养大鼠皮层神经元乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放,和TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)含量升高及制备的皮层线粒体TBARS含量升高的影响。结果表明:超氧阴离子和羟自由基引起了培养神经元和线粒体明显的损伤。浓度在5～50μmol·L^-1之间,ebselen能剂量依赖性地抑制LDH释放和TBARS含量的增加,对线粒体的TBARS含量升高也有显著的抑制作用。但浓度为0.2～50μmol·L^-1时,药物无直接清除超氧阴离子和羟自由基的活性。因此,ebselen对氧自由基诱发的神经元脂质过氧化损伤有拮抗作用,这种作用与直接清除自由基无关。     

丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制

本研究探讨丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制。原代培养大鼠大脑皮质神经元，建立氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)，采用MTT法、酶学检查、免疫组化、RT-PCR等观察丁基苯酞(各浓度组)的保护作用及其机制。在氧糖剥夺4 h/复氧8 h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH(乳酸脱氢酶)的释放，可显著降低神经元表达iNOS mRNA(诱生型一氧化氮合酶)和NF-κB(核因子κB) p65蛋白(增加)。不同剂量丁基苯酞(100、 10、 1和0.1 μmol·L^-1)在增加细胞活力、减少LDH释放及降低神经元表达iNOS mRNA等方面，高浓度的作用强于低浓度，且丁基苯酞100 μmol·L^-1组与吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC) 100 μmol·L^-1组差异显著。在OGD 4 h/R 8 h时丁基苯酞可能抑制iNOSmRNA的表达及NF-κB的活化，从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元。     

粉防己碱对体外培养大鼠脑皮层神经元损伤的保护作用

兴奋性氨基酸类神经毒剂与粉防己碱(Tet)共同作用于原代培养胎鼠大脑皮层神经元24h,发现10^-7,10^-6mol·L^-1Tet明显降低谷氨酸(Glu),β-N-oxalylamino-L-alanine(BOAA)和β-N-methylamino-L-alanine(BMAA)导致的培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性增高,细胞形态损害减轻,细胞数量增加。对NMDA介导的神经元损伤改变无影响。提示Tet对某些Glu类神经毒剂引起的胎鼠大脑皮层神经元损伤有一定保护作用,其机制可能是抑制细胞膜Na⁺通道开放,阻止膜去极化而影响电压依赖性Ca²⁺通道启动。对NMDA受体可能亦有一定作用。     

神经生长因子对培养的脑皮质神经元谷氨酸毒性的影响

在原代培养的大鼠胎鼠脑皮质神经元，观察神经生长因子(NGF)对谷氨酸损伤的影响. 谷氨酸(0.2-0.8 mmol·L^-1) 促进神经元死亡及乳酸脱氢酶(LDH)释放，增加丙二醛(MDA)含量. NGF 3-100 μg·L^-1浓度依赖地抑制谷氨酸引起的神经元死亡及LDH和MDA的增加. NGF 30 μg·L^-1提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶活力. NGF浓度依赖地增加谷氨酸引起的抗氧化酶水平降低. 结果提示NGF通过抑制脂质过氧化物生成及提高抗氧化酶活性来保护大脑皮质细胞抗谷氨酸毒性.     

糖皮质激素促进β-淀粉样蛋白对海马神经元损伤的研究

目的在体外实验条件下,观察糖皮质激素是否促进β-淀粉样蛋白的神经元毒性作用。方法通过LDH释放率法检测细胞活力、TUNEL法测细胞凋亡以及LSCM测胞内Ca²⁺浓度的变化。结果单独的地塞米松(10^-8,10^-7,10^-6mol·L^-1)组或Aβ25-35(0.5μmol·L^-1)组分别作用海马神经元后,细胞活力变化不明显(P>0.05);但与同剂量的DEX、Aβ_25-35组相比,DEX+Aβ_25-35组的细胞活力明显降低(P<0.05),同时胞内Ca²⁺显著上升(P<0.05),神经元的凋亡率增加明显,细胞内出现凋亡的典型形态学特征。结论糖皮质激素可能通过促进Aβ引起海马神经元胞内Ca²⁺升高增加神经元毒性作用。     

牛樟芝胶囊对大鼠四氯化碳肝损伤的保护作用研究

摘 要 目的: 观察牛樟芝胶囊对四氯化碳（CCl-4）所致大鼠肝损伤的保护作用,并与甘草酸二铵胶囊作用效果进行比较。方法: 用CCl-4制备大鼠中毒性肝损伤模型,观察牛樟芝胶囊对大鼠血清中ALT、AST和乳酸脱氢酶（LDH）变化的影响,以及对肝脏病理损伤的作用。结果:模型对照组与阴性对照组比较,动物体质量降低,肝脏绝对质量（15.13±2.01）g和相对质量（4.32±0.36）g/100 g增高,ALT（189.9±50.4 )IU·L^-1、AST（249.1±47.6)I U·L^-1、LDH（1 740.8±522.0)IU·L^-1均显著增高（P<0.05）,肝组织病理损伤明显加重,肝损伤模型成立。中剂量牛樟芝胶囊（1.08 g·kg^-1）可使肝损伤大鼠的ALT（126.7±31.4）IU·L^-1、AST（175.2±38.9）IU·L^-1、LDH（1 013.7±342.5）IU·L^-1明显降低（P<0.05）;高剂量牛樟芝胶囊（1.62 g·kg^-1）可使肝损伤大鼠的ALT（138.0±50.0）IU·L^-1和AST（189.1±56.7）IU·L^-1明显降低（P<0.05）,肝组织病理损伤明显改善（P<0.05）,优于甘草酸二铵胶囊。 结论:牛樟芝对大鼠CCl-4肝损伤有保护作用。     

超低分子肝素对原代培养大鼠大脑皮质神经元化学诱导损伤的保护作用

目的探讨超低分子肝素(ULMWH)对不同化学诱导损伤大脑皮质神经元的保护作用。方法谷氨酸、叠氮钠、KCl和咖啡因诱导损伤原代培养的大鼠大脑皮质神经元,观察神经元存活率、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量及细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)。结果ULMWH(0.01～1.0mg.L-1)预处理24h可显著提高谷氨酸损伤神经元的存活率,降低细胞LDH的漏出量和[Ca2+]i,高浓度(1.0mg.L-1)时对叠氮钠引起的神经元损伤也有一定的保护作用,但对咖啡因和KCl所致的神经元损伤无影响。结论ULMWH对谷氨酸和叠氮钠所致大鼠大脑皮质神经元损伤有一定的保护作用,可能与其抑制[Ca2+]i升高有关;但不能对抗KCl和咖啡因所致的皮质神经元损伤。     

钾通道阻断剂部分抑制三氧化二砷诱导的HeLa细胞死亡

目的研究钾通道阻滞剂对三氧化二砷诱导的HeLa细胞死亡的作用。方法采用MTT法评价HeLa细胞的存活情况，采用膜片钳技术记录HeLa细胞的电压依赖性钾电流。结果As₂O₃(5 μmol·L^-1)孵育24 h引起显著的HeLa细胞死亡，As₂O₃(5 μmol·L^-1)孵育24 h后存活的细胞表现明显的电压依赖性钾电流密度增加。+80 mV电压下，As₂O₃(5 μmol·L^-1)孵育组电流密度(61±18) pA/10 pF(n=8)明显高于对照组(38±10) pA/10 pF(n=8,P<005)。As₂O₃诱导的HeLa细胞死亡可被共同孵育钾通道阻滞剂四氨基吡啶(3 mmol·L^-1)或四乙基铵(5 mmol·L^-1)所部分抑制。3 mmol·L^-1四氨基吡啶或5 mmol·L^-1四乙基铵对HeLa细胞无明显细胞毒作用。结论As₂O₃长期处理增加HeLa细胞的电压依赖性钾电流。As₂O₃诱导的HeLa细胞死亡可被钾通道阻滞剂四氨基吡啶或四乙基铵部分抑制。     

灯盏花素对谷氨酸诱导大鼠海马神经细胞毒性的保护作用

选用培养的海马神经细胞研究灯盏花素(breviscapine，Bre)对谷氨酸(glutamate，Glu)诱导神经细胞毒性的保护作用及其机制。新生大鼠海马神经细胞体外培养8 d后， 用L-谷氨酸(0.1， 0.5及1.0 mmol·L^-1)处理30 min； 灯盏花素处理组在加入L-谷氨酸的同时给予不同剂量的灯盏花素(10， 20及40 μmol·L^-1)； 继续正常培养24 h后， 用Annexin V联合流式细胞仪检测细胞的凋亡和坏死率； RT-PCR分析凋亡蛋白抑制剂XIAP mRNA的表达。结果表明， L-谷氨酸浓度依赖性地诱导神经细胞发生凋亡和坏死， 并使细胞XIAP mRNA表达发生浓度依赖性的双向变化： 0.1 mmol·L^-1 L-谷氨酸使神经细胞XIAP mRNA表达增强， 而较高浓度使XIAP mRNA表达下调。灯盏花素(20和40 μmol·L^-1)可有效抑制谷氨酸诱导的神经细胞死亡， 分别使细胞凋亡率下降30.4%和40.1%， 坏死率下降32.5%和38.8%； 并上调XIAP mRNA表达45.1%和54.9%。激光共聚焦显微技术联合Fluo-3荧光标记检测表明，L-谷氨酸处理过程中海马神经细胞内Ca²⁺水平显著升高， 而灯盏花素可抑制谷氨酸引起的细胞内Ca²⁺超载(P<0.01)。以上结果提示， 灯盏花素可能通过抑制细胞Ca²⁺超载， 调节凋亡抑制因子XIAP的表达而有效保护谷氨酸对神经细胞的兴奋性毒性作用。     

吗啡增强谷氨酸单钠神经毒性及其作用机制

用皮层神经细胞体外培养、形态学观察、单个神经细胞内游离钙检测及乳酸脱氢酶(LDH)测定等方法,观察了吗啡对谷氨酸单钠(MSG)神经毒性增强作用以及纳洛酮对吗啡作用的逆转,分析了其可能的作用机制。结果表明:吗啡能显著增强的MSG的细胞毒作用.纳络酮可逆转这种增强作用,细胞内Ca²⁺超载可能是兴奋性神经毒素引起神经元死亡的共同病理学机制。     

大鼠脑片损伤模型和新型定量评价方法的建立

目的　建立不同性质脑损伤实验模型和一种方便、快速、灵敏的定量评价方法。方法　制备大鼠皮层和海马脑片 ,检测活性后 ,分别接受缺氧缺糖 (OGD)、谷氨酸、过氧化氢 (H2 O2 )损伤 ,氯胺酮、D AP5、异丙酚预处理 ,随后与TTC溶液共同孵育 ,有机溶剂抽提 ,酶标仪测定OD4 90 值 ,同时测定孵育上清液乳酸脱氢酶 (LDH)释放率。结果　室温下恢复孵育 90min后 ,海马脑片CA1区锥体细胞层可记录到群体峰电位。随着OGD时间延长 ,皮层和海马脑片TTC染色明显降低 ,孵育上清液LDH释放率逐渐增加 ,组织损伤百分率与LDH释放率明显正相关 :皮层r =0 960 9,P <0 0 1 ;海马r =0 892 1 ,P <0 0 5。和对照组相比 ,谷氨酸 1mmol·L- 1 和H2 O2 2mmol·L- 1 明显降低脑片TTC染色。氯胺酮5μmol·L- 1 、D AP550 μmol·L- 1 、异丙酚 5μmol·L- 1 分别抑制OGD 1 0min、谷氨酸、H2 O2 损伤所致脑片TTC染色降低。结论　利用大鼠脑片建立的缺氧缺糖、谷氨酸和过氧化氢损伤实验模型 ,以及新鲜脑片与TTC溶液共同孵育 ,有机溶剂抽提、比色的定量评价方法具有方便、快速、灵敏的特点 ,能有效的用于脑缺血损伤和药效评价的研究     

次乌头碱对乳大鼠原代培养心肌细胞的毒性作用

目的探讨次乌头碱(HA)对心肌细胞的毒性作用。方法制备乳大鼠原代心肌细胞,用锥虫蓝染色法检测心肌细胞存活率,用小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白和兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体免疫化学染色法鉴定心肌细胞。制备的原代细胞培养3～4d,分别加入HA0,3,6,30,60和120μmol·L-1培养5,15,30和60min,记录每组细胞搏动频率;以HA体外引起心肌细胞搏动消失的浓度及作用时间为依据,将心肌细胞分为培养基对照,二甲亚砜(DMSO)对照,HA30,60和120μmol·L-1组,分别连续培养5,15,30和60min,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,倒置显微镜下观察细胞形态的变化。结果与HA0μmol·L-1组比较,HA30μmol·L-1与心肌细胞作用5,15,30和60min时细胞搏动频率增加,由40±26,42±27,38±19和(20±10)min-1分别增加到114±27,98±32,100±32和(49±13)min-1(n=12,P<0.01);HA120μmol·L-1立即导致心肌细胞停搏。不同浓度的HA随着作用时间的延长,导致LDH漏出率不同程度的增加,其中HA30,60和120μmol·L-1作用60min时细胞LDH漏出率分别为(29±8)%,(42±10)%和(57±9)%与同一时间点DMSO组比较有明显差异(P<0.01)。倒置显微镜观察发现,随着HA浓度的增加和作用时间的延长,心肌细胞有死亡现象。结论 HA对心肌细胞有毒性作用,主要表现为细胞搏动频率加快,细胞膜稳定性破坏;HA120μmol·L-1与心肌细胞作用超过120min会引起少量心肌细胞死亡。     

皮质酮对原代培养大鼠海马神经细胞的毒性作用及其与兴奋性氨基酸的关系

探讨了皮质酮对原代培养海马神经细胞的毒性作用及作用机理. 结果显示,无血清培养基中加入皮质酮（10 nmol·L^-1-0.1 mmol·L^-1）可浓度依赖地损伤原代培养的海马和皮层神经细胞,其EC₅₀分别为3.2 和85 μmol·L^-1. 预先加入N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂地佐环平(MK 801,终浓度为50 μmol·L^-1）可显著拮抗皮质酮（10 μmol·L^-1）对海马神经细胞的毒性作用. 皮质酮同海马脑薄片共同孵育10和20 min可明显增加海马脑薄片谷氨酸和谷氨酰胺的释放,对天冬氨酸的释放则无明显影响. 实验结果提示,皮质酮可选择性地损伤原代培养海马神经细胞,该毒性作用可能与其增加兴奋性氨基酸释放有关.     

吡格列酮对谷氨酸诱导的皮质神经元损伤的保护作用

目的观察吡格列酮对谷氨酸所致培养皮质神经元损伤的保护作用及其机制。方法乳大鼠大脑皮质神经元,培养7d后用于实验。实验分为对照组,加入0.1%二甲亚砜;谷氨酸损伤组,加入谷氨酸100μmol·L-1作用2h或24h;吡格列酮组,先分别加入吡格列酮0.01,0.1和1μmol·L-1作用1h,然后加入谷氨酸;谷氨酸+吡格列酮+GW9662组,先加入GW966210μmol·L-1作用30min,然后加入吡格列酮1μmol·L-1,作用1h后加入谷氨酸。MTT法测定细胞存活率;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变;Western印迹法检测Bcl-2蛋白、钙蛋白酶Ⅰ蛋白和磷酸化c-Jun氨基端激酶1(JNK1)表达水平;免疫荧光染色法检测钙蛋白酶Ⅰ及磷酸化活化转录因子2(ATF2)表达。结果谷氨酸作用24h可使体外培养神经元细胞存活率明显下降,从对照组的(100.0±15.4)%降低至(71.5±6.1)%;细胞凋亡百分率明显增加,从对照组的(8.7±1.3)%增加至(35.4±6.9)%;磷酸化JNK1、钙蛋白酶Ⅰ蛋白和磷酸化ATF2表达增加,Bcl-2蛋白表达水平降低。吡格列酮0.1及1μmol·L-1明显对抗谷氨酸引起的神经元损伤,神经元细胞存活率分别为(91.1±4.7)%和(96.6±3.4)%;细胞凋亡百分率分别为(15.5±3.8)%和(9.2±0.9)%。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的特异性阻断剂GW9662不能拮抗吡格列酮对神经元的保护作用,谷氨酸+吡格列酮+GW9662组细胞存活率为(91.3±6.7)%,细胞凋亡百分率为(10.2±1.8)%。单独应用GW966210μmol·L-1对细胞存活率和细胞凋亡百分率没有影响。吡格列酮也可抑制谷氨酸引起的磷酸化JNK1、磷酸化ATF2、钙蛋白酶Ⅰ表达增多及Bcl-2蛋白表达减少。结论吡格列酮对谷氨酸引起的培养皮质神经元损伤具有明显的保护作用,可能与吡格列酮抑制磷酸化JNK1和钙蛋白酶Ⅰ表达,以及增强Bcl-2蛋白表达有关,与PPARγ激活无关。     

粉防己碱对胎鼠大脑细胞游离钙含量的影响

结果表明,粉防己碱(Tet)非常明显地阻断K+去极化导致的胎鼠大脑[Ca²⁺]i含量的增加。经不同浓度Tet处理的大脑细胞加入KCl后,[Ca²⁺]i含量仍基本维持在静息状态下水平。对[Ca²⁺]i的阻断程度与Tet浓度无关。Tet对L-谷氨酸(L-Glu)所致大脑[Ca²⁺]i升高亦有明显抑制作用。10^-7mol·L^-1浓度的Tet还降低BayK8644引起的[Ca²⁺]i上升高。Tet能抑制高K⁺,二氢吡啶类钙激动剂及兴奋性神经递质导致的胎鼠大脑[Ca²⁺]i含量增加,提示Tet对神经细胞损伤可能有一定保护作用。     

AMG-1和腺苷对大鼠脑突触体谷氨酸释放的影响

观察了腺苷类化合物AMG-1对大鼠脑突触体前膜谷氨酸(glu)释放的影响。AMG-1在0.1～0.3 mmol·L^-1能明显抑制突触前膜Ca²⁺-依赖性glu的释放,并呈现剂量—效应关系。其作用强度与腺苷基本相似。提示AMG-1对脑保护作用可能与它激活腺苷A₁受体,从而抑制兴奋性氨基酸释放有关。