作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物筛选模型的建立及初步应用

铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌，根据外排泵是铜绿假单胞菌产生耐药性的主要原因这一原理，以铜绿假单胞菌的外排泵为靶点，用过量表达外排泵的铜绿假单胞菌Y5和外膜微孔蛋白（OprD2)缺陷菌株7208以及铜绿假单胞菌标准菌株PAO1建立了一个作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物筛选模型。应用此模型可以初筛作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物以及与现有已知的抗生素有协同作用的活性物质的筛选，应用所建立的方法从2449株微生物发酵液中（真菌1700株，放线菌700株，海洋细菌49株）筛选得到4株阳性菌，多次发酵表明这4株阳性菌产生抗铜绿假单胞菌的活性物质的性质比较稳定，进一步的工作正在进行之中。     

铜绿假单胞菌中乙酰化褐藻胶的生物合成和功能研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上三大机会致病菌之一,可导致多种急慢性感染。铜绿假单胞菌感染人体后,往往会转变成过量产生乙酰化褐藻胶的粘液型细菌,并形成生物被膜(biofilm)。一旦形成生物被膜,细菌将具有极强的抗生素耐药性和逃避机体免疫系统攻击的能力,造成临床上难治性、持续性感染。乙酰化褐藻胶是P. aeruginosa 生物被膜的主要成分,决定了生物被膜的结构与功能。因此,本文从乙酰化褐藻胶的生物合成途径及调控机制、在细菌中的生物学功能及作为抗菌药物开发靶点等几个方面进行了综述。     

作用于铜绿假单胞菌外膜的药物初筛方法的建立及初步应用

用铜绿假单胞菌外膜微孔蛋白（ＯｐｒＤ２）缺陷菌株７２０８和铜绿假单胞菌标准菌株ＰＡＯ１建立了一个作用于铜绿假单胞菌外膜蛋白的药物初筛模型。通过不同类型抗生素的验证，证明了该模型对碳青霉烯类化合物有较高的特异性，可用于初筛。另外，利用本初筛模型也可筛选到与β－内酰胺类抗生素有协同作用的活性物质或造成外膜缺损的化合物。应用所建立的初筛方法，从１２５５株放线菌中筛选到１１株阳性菌株，但其作用机制是否对外膜有作用尚需作进一步研究     

大环内酯类药物治疗铜绿假单胞茵慢性感染机制的研究进展

近年来大量研究表明长期应用大环内酯类药物或大环内酯类药物与其它抗生素联用均能有效控制铜绿假单胞菌所致的慢性感染.大环内酯类在治疗铜绿假单胞菌慢性感染方面主要具有①抑制铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的产生;②影响铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统,减少毒力因子的产生;③破坏铜绿假单胞菌表面结构,抑制细菌对宿主的黏附;④抑制细菌QS系统.减少自身信号诱导分子的合成;⑤增加炎症细胞聚集.减少炎性细胞凋亡,对抗机体的炎症反应;⑥增加呼吸道痰液的清除,降低痰液粘稠度;⑦对铜绿假单胞菌具有暴露时间依从性杀菌活性等方面的功能,能最终达到对铜绿假单胞菌慢性感染的有效控制.     

大环内酯类药物治疗铜绿假单胞菌慢性感染机制的研究进展

近年来大量研究表明长期应用大环内酯类药物或大环内酯类药物与其它抗生素联用均能有效控制铜绿假单胞菌所致的慢性感染。大环内酯类在治疗铜绿假单胞菌慢性感染方面主要具有：①抑制铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的产生；②影响铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统，减少毒力因子的产生；⑧破坏铜绿假单胞菌表面结构，抑制细菌对宿主的黏附；④抑制细菌QS系统，减少自身信号诱导分子的合成；⑤增加炎症细胞聚集，减少炎性细胞凋亡，对抗机体的炎症反应；⑥增加呼吸道痰液的清除，降低痰液粘稠度；⑦对铜绿假单胞菌具有暴露时间依从性杀菌活性等方面的功能，能最终达到对铜绿假单胞菌慢性感染的有效控制。     

细菌生物膜抑制剂3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮联合庆大霉素对铜绿假单胞菌的抑制作用

目的:试验细菌生物膜抑制剂3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮与庆大霉素联用对铜绿假单胞菌的抑制效果。方法:通过测试卤代呋喃酮化合物的M IC和细菌生物膜抑制活性筛选出具有较好活性的3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮。分别采用正交试验方法、棋盘法对庆大霉素与3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮联用抑制铜绿假单胞菌的效果进行分析。结果:庆大霉素与3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮联用抑制细菌生长实验显示两者均是重要因素;棋盘法实验结果显示庆大霉素与3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮联用时抑菌作用相加。结论:庆大霉素联用3,4-二氯呋喃-2(5H)-酮化合物对抑制铜绿假单胞菌的生长存在有效的相加作用。     

5个恶唑烷酮类新化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制研究

目的 以铜绿假单胞菌PAO1为模式菌,研究恶唑烷酮类新化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用及其作用机制。方法 测定5个恶唑烷酮类新化合物对PAO1生物膜、绿脓菌素、运动能力抑制活性,采用qRT-PCR测试其对群体感应相关基因的下调作用,并评估化合物对秀丽隐杆线虫感染模型的保护活性。结果 化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对PAO1生物膜、绿脓菌素、运动能力具有较强的抑制活性,其作用机制均是并显著下调PAO1中10个已知的受群体感应系统正调控的基因。化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对秀丽隐杆线虫感染模型具有良好的体内保护活性,其中化合物SIIA-MA2对急性感染模型具有显著保护活性;化合物SIIA-MA4对慢性感染模型具有显著保护活性。结论 恶唑烷酮类新化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4通过抑制PAO1群体感应系统发挥抗感染作用。     

D-环丝氨酸抑制铜绿假单胞菌群体感应活性研究

摘要：目的 以铜绿假单胞菌模式菌株PAO1为研究对象,研究抗结核药物D-环丝氨酸通过靶向抑制病原菌群体感应 (quorum-sensing,QS)系统实现抑制病原菌毒力发挥的新应用潜力。方法 用不同浓度的D-环丝氨酸处理铜绿假单胞菌,通过 系列表型实验结合荧光定量PCR以评估D-环丝氨酸对群体感应所调节的毒力因子和相应基因表达的影响,并利用秀丽隐杆线虫 感染模型评估D-环丝氨酸对铜绿假单胞菌毒力抑制的体内活性。结果 D-环丝氨酸表现出良好的铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌 素以及蛋白水解酶抑制活性,显著抑制了QS系统调控基因和下游功能基因的表达,并且可以显著提高秀丽隐杆线虫在铜绿假单 胞菌感染过程的存活率。结论 D-环丝氨酸可以有效抑制铜绿假单胞菌群体感应系统,有望开发成功的抗生素替代药物。     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离筛选和体内外抗菌活性研究

目的:分离筛选针对铜绿假单胞茵的强裂解性噬菌体,并研究其生物学特性和体内外抗菌活性.方法:药敏纸片法筛选铜绿假单胞菌的耐药菌株,以此为宿主菌,采用双层平板法和斑点法分离筛选噬菌体并分析其生物学特性,透射电镜观察噬菌体的微观形态,检测噬菌体和细菌共培养液的OD600值分析体外抗菌活性,建立小鼠全身感染模型评估噬菌体疗效.结果:分离获得3株铜绿假单胞菌噬菌体,从中筛选出一株宽谱的强裂解活性噬菌体PPa24.PPa24属于长尾噬菌体科,其在55℃以下、pH6～10条件下活性稳定,最佳感染复数为0.1,一步生长曲线显示PPa24感染宿主菌的潜伏期为20 min、裂解期为70 min、裂解量为62 PFU· cell-1.噬菌体PPa24可以有效降低细菌培养物的OD600值,用来治疗小鼠全身感染可显著降低血液载菌量(P＜0.01),并使存活率提高至75％ (P＜0.001).结论:筛选得到的噬菌体PPa24在抗击铜绿假单胞菌感染方面初步显示了良好的体内外活性,可能成为治疗铜绿假单胞菌感染的潜在抗菌剂.     

亚胺培南联合罗红霉素对铜绿假单胞菌生物被膜的作用

目的本实验研究了罗红霉素对铜绿假单胞菌生物被膜合成的抑制及其与亚胺培南的抗菌增效作用。方法色氨酸法测定多糖蛋白复合物（GLX）;噻唑兰法测定活菌数。结果1／16MIC、1／4MIC的罗红霉素可以显著抑制细菌生物被膜多糖蛋白复合物的合成。1／16MIC、1／4MIC的罗红霉素可以显著增强1／4MIC,1／2MIC及1MIC的亚胺培南对生物被膜细菌的抑菌活性。结论罗红霉素本身对铜绿假单胞菌并无抑菌活性而可以抑制多糖蛋白复合物的合成,显示罗红霉素能提高亚胺培南对生物被膜的渗透从而增强其对铜绿假单胞菌生物被膜的抑菌活性。     

Hydrophobic interactions in complexes of antimicrobial peptides with bacterial polysaccharides

Biofilms of Pseudomonas aeruginosa are responsible for chronic lung infections in cystic fibrosis patients, where they are characterized by overproduction of the exopolysaccharide alginate and are recalcitrant to treatment with conventional antibiotics. Cationic antimicrobial peptides (CAPs) are potential alternatives for the treatment of multi-drug-resistant P. aeruginosa. However, alginate in P. aeruginosa biofilms has been proposed to bind these peptides through hydrophobic interactions, consequently reducing their activity [Chan et al., J Biol Chem 2004; 279: 38749-38754]. Here we perform biophysical analyses of the interactions of alginate with a series of novel peptide antibiotics (alpha-CAPs) of prototypic sequence KK-AAAXAAAAAXAAWAAXAAA-KKKK (where X = Phe, Trp or Leu). The hydrophobic interaction interface in alginate was investigated by examining (i) the effects of polysaccharide composition with respect to D-mannuronate and L-guluronate content; (ii) glycan chain length; (iii) alpha-CAP Trp fluorescence; and (iv) 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate fluorescence. The results show that, while M and G residues produce equivalent effects, hydrophobic interactions between alginate and alpha-CAPs require a minimal glycan chain length. Peptide interactions with alginate are deduced to be mediated by hydrophobic microdomains comprised of pyranosyl C-H groups that are inducible upon formation of alpha-CAP-alginate complexes due to charge neutralization between the two species.     

铜绿假单胞菌定量冷冻干燥菌球与新鲜制备菌悬液用于胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检查的研究

目的：探讨使用铜绿假单胞菌CMCC(B)10104定量冷冻干燥菌球制备菌悬液(以下简称冻干型菌悬液)与新鲜制备菌悬液(以下简称新鲜型菌悬液)评价胰酪大豆胨琼脂培养基适用性的差异。方法：将铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冻干型菌悬液和新鲜型菌悬液分别涂布5种市售胰酪大豆胨琼脂培养基,获得培养物的菌落数量、菌落平均直径及肉眼可见菌落出现时间,使用SPSS软件进行统计学分析。结果：铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冻干型菌悬液与新鲜型菌悬液的差异主要体现在菌落平均直径上,前者大于后者。铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冻干型菌悬液在不同品牌胰酪大豆胨琼脂培养基平板上菌落计数明显不同。结论：使用铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冻干型菌悬液更利于筛选对损伤菌促生长能力强的培养基,可以用于计数培养基(胰酪大豆胨琼脂培养基)适用性检查。     

Synthesis and microbiological activity of some novel 5-benzamido- and 5-phenylacetamido-substituted 2-phenylbenzoxazole derivatives

The synthesis and microbiological activity of a new series of 5-benzamido- and 5-phenylacetamidosubstituted-2-phenylbenzoxazole derivatives (1-26) were described. The in vitro microbiological activity of the compounds was determined against Gram-positive, Gram-negative bacteria and the yeast Candida albicans in comparison with standard drugs. Microbiological results indicated that the synthesized compounds possessed a broad spectrum of activity against the tested microorganisms. The compounds 1, 21, 25 showed higher activity than tetracycline and streptomycin against Pseudomonas aeruginosa.     

AmpC酶阳性铜绿假单胞菌及整合子相关的多重耐药性

目的 筛选铜绿假单胞菌酶阳性菌株,研究整合子参与的耐药机制.方法 用K-B法进行药敏实验,15个纸片表型筛选和三维试验;PCR扩增及PCR定位.结果 铜绿假单胞菌对阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星、头孢派酮/舒巴坦和庆大霉素等耐药率较高(>50%);对亚胺培南也有一定的耐药率(16.7%).表型筛选AmpC酶阳性率为37.5%,三维试验为30%;PCR扩增ampC的阳性率为91.2%;ampD的阳性率为87.5%;PCR定位研究的阳性率为33.3%,阳性片段均小于1 000 bp.结论 表型筛选与三维试验无显著性差异,表型筛选更方便用于临床;插入的AmpC酶耐药基因可能位于整合子上游.     

氟哌酸滴眼液对兔眼损伤型绿脓杆菌性角膜炎、角膜溃疡的预防和治疗

本文系用环钻损伤兔眼浅层角膜,感染绿脓杆菌,造成损伤型绿脓杆菌性角膜炎动物模型;采用氟哌酸滴眼液滴眼治疗。结果表明,氟哌酸滴眼液对绿脓杆菌性角膜炎具有明显的治疗作用,同时能有效地预防角膜溃疡的形成。     

抗生素对铜绿假单胞菌产生藻酸盐的影响

藻酸盐为铜绿假单胞菌生物膜的主要成分，为了探讨药物对铜绿假单胞菌产生藻酸盐的影响，对在含不同浓度红霉素和不同浓度头孢唑肟的普通琼脂培养基上生长的铜绿假单胞菌，采用高效液相色谱法测定其所产生的藻酸盐，结果红霉素对铜绿假单胞菌产生藻酸盐物质有抑制作用，而头孢唑肟则不能抑制藻酸盐的产生。说明红霉素对防治慢性铜绿假单胞菌感染症有意义。     

铜绿假单孢菌生物被膜相关大鼠肺慢性感染免疫逃逸的研究

将藻酸盐-粘液型铜绿假单胞菌接种于免疫抑制大鼠，感染两周后，应用菌落计数法测定大鼠肺内存活菌数，光镜、透射电镜观察大鼠肺部病理改变，ELISA方法测定大鼠外周血IgG抗体，建立了稳定的铜绿假单胞菌生物被膜相关肺慢性感染大鼠模型，探讨铜绿假单胞菌生物被膜相关感染免疫逃逸现象。     

铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究

目的建立一种检测下呼吸道感染分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南(IMP)耐药的筛选方法并研究其耐药机制。方法114株铜绿假单胞菌，用KB法筛选出亚胺培南耐菌株、可疑耐药株和敏感株；然后提取部分菌株外膜蛋白，进行SDS—PAGE电泳，比较三组菌株外膜蛋白的差异。结果114株铜绿假单胞菌中有13株耐药，37株可疑耐药(IMP抑菌圈内出现散在小菌落)3株中敏，61株敏感。在外膜蛋白SDS-PAGE电泳图谱上发现敏感株存在OprD2、OprE带，但耐药株、可疑耐药株缺乏OprD2；OprE带缺乏或者染色较淡。定量分析发现耐药株和可疑耐药株OprD2、OprE含量明显低于敏感株。结论KB法可以筛选出IMP可疑耐药的铜绿假单胞菌；IMP抑菌圈内出现散在菌落的菌株是耐药株；铜绿假单胞菌对IMP耐药的主要原因与外膜蛋白OprD2和OprE缺失或含量明显减少有关。