树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肺癌的实验研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外能否有效的抗肺癌。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM—CSF,IL-4及TNF—a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN—g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物．作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。CytotoxicityTOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性。结果在培养的第15d．与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23．4±2．3）倍vs（16．7±2．7）倍,P〈0．05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64．3±3．6）％vs（43．9±2．1）％,P〈0．05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强。结论DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK抗肺癌的活性．将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

肿瘤干细胞来源的DC-CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤作用

【摘要】目的 观察干细胞负载树突细胞诱导的杀伤细胞（CSC-DC-CIK）作为效应细胞对同源肿瘤细胞的杀伤作用,探讨CSC 抗原参与肿瘤杀伤作用的可行性。方法 培养肾癌细胞株A498 和肺癌细胞株A549,用流式分选术分离纯化CD133+细胞,分别作为肾癌干细胞（KSC）和肺癌干细胞（LSC）,冻融法制备抗原。提取健康产妇脐带血的单个核细胞,体外扩增诱导生成DC 和CIK 细胞。分别用上述CSC 抗原负载DC,与CIK 共培养（CSC-DC-CIK）,流式细胞术分析DC 和CIK 细胞免疫表型,ELISA 法检测细胞因子分泌水平,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测CSCDC- CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤效率。结果CSC-DC 的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及HLA-DR+的表达均高于单纯DC 的相应免疫表型的表达（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+ 及HLA-DR+的表达均高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及 HLA-DR+的表达高于DC 与CIK 共培养后的相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+的表达高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+ 的表达高于DC 与CIK 共培养后的CIK 相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和 IL-2 分泌水平高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和IL-2 分泌水平高于DC 与CIK 共培养后的相应细胞因子表达（P < 0.01）;KSC-DC-CIK 组和LSC-DC-CIK 组对靶细胞的杀伤率为（50.21±4.24）% 和（49.32±3.89）%,明显高于DC-CIK 组的（30.25±3.11）%（F=89.157,P < 0.01）。结论 CSC 抗原负载DC 活化CIK （CSC-DC-CIK）对同源肿瘤细胞有更好的杀伤作用,对其作用机制和临床应用的可能性尚需深入研究。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗肺癌的实验效应研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外对肺癌的影响。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。用流式细胞仪分析细胞表型,自体混合淋巴细胞反应和异体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的的增殖活性。Cytotoxicity TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性,同时用A549细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肺癌活性。结果在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23.4±2.3）倍vs（16.7±2.7）倍,P〈0.05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64.3±3.6）%vs（43.9±2.1）%,P〈0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强,体内实验显示,与单独培养的CIK细胞相比,与负载抗原的DC共同培养的CIK,可明显抑制接种瘤细胞的裸鼠成瘤率,DC＋CIK与负载抗原的DC＋CIK在抗六效应上没有明显差异。结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK体内抗肺癌的活性。将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

来源于干细胞的树突细胞激活免疫细胞对同源白血病干细胞的杀伤作用

目的:探讨白血病干细胞(LSC)来源的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养对自身LSC的杀伤作用.方法:提取慢性粒细胞白血病加速期(CML-AP)患者的骨髓单个核细胞(BMMC),再应用CD34+CD38CD44+标记BMMC,流式分选仪分选出LSC并扩增、诱导出DC.取同源的单个核细胞诱导出CIK.用流式细胞技术检测DC和CIK细胞免疫表型、DC的p-糖蛋白(P-gp)耐药蛋白表达.荧光原位杂交(FISH)技术检测BCR/ABL融合基因在LSC及DC中的表达,乳酸脱氢酶释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效应.结果:CIK与DC共培养后,CD40、CD80、CD83及人类白细胞抗原(HLA-DR)的构成均高于共培养前;CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表达率高于共培养前,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01).干细胞来源DC的P-gp表达阳性率为(60.61±12.38)％.3种效靶比对应的杀伤率差异有统计学意义(P＜0.01),随着效靶比的增加,细胞杀伤作用增强.结论:白血病干细胞来源DC功能正常,与CIK共培养对自身LSC有杀伤作用.     

耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探

目的 耐药乳腺癌表现为治疗效果差,转移率高,死亡率高的一种恶性程度极高的肿瘤性疾病。有研究表明,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在树突细胞（DC）辅助下,对耐药肿瘤细胞的杀伤能力可能超过T细胞。本实验利用DC与CIK联合培养,比较在不同条件下对乳腺癌多药耐药细胞株的杀伤效应。 方法 分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为树突细胞（DC）和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC（AP-DC）,分别将DC与CIK细胞共培养（AP-DC+CIK 、DC+CIK）,CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,酶联免疫吸附法（ELISA）测定分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,MTT法测定细胞毒效应。结果 DC和CIK细胞共孵育,使CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例及分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平增高,DC的成熟表型和分泌IL-12的水平增加,其中均以AP-DC+CIK组增高最为明显,和其他组间比较差异有统计学意义。对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒效应,AP-DC+CIK组杀伤效应最强, 与DC+CIK组和CIK组比较差异均有统计学意义;结论 经耐药肿瘤抗原负载的DC与CIK共同作用后,其对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抗瘤免疫能力最强,为临床治疗耐药肿瘤带来希望。     

树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

痤疮丙酸杆菌促树突状细胞前体细胞动员及其对胃癌的治疗效应

目的利用痤疮丙酸杆菌（P．aches）引起的炎症反应，促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员并研究P．aches动员的DC在体外对胃癌细胞的作用。方法C578BL／6J（B6）小鼠注射P．aches后外周血分离单个核细胞，用流式细胞仪分选F4／8013220-CD11c^＋细胞，在体外加入细胞因子GM-CSF、IL4和TNFα共培养，通过形态学观察、表型分析和混合淋巴细胞反应鉴定它们是否能分化为成熟DC。将P．aches动员的DC负载胃癌抗原后致敏T细胞，观察活化的T细胞在体外对胃癌细胞的杀伤效应。结果注射P．aches1h后外周血F4／80B220-CD11c^＋细胞数量即开始升高，24h后逐渐达到高峰。新鲜分离的细胞不具有成熟DC的特征。与细胞因子共培养后即具有典型的DC形态和表型，在混合淋巴细胞反应中具有极强的刺激T细胞增殖的能力。P．aches动员的DC负载胃癌抗原后致敏T细胞对胃癌细胞的杀伤率明显高于未致敏T细胞。结论P．aches可迅速动员F4／80-B220-CD11c^＋细胞进入小鼠外周血，经细胞因子的诱导后可分化为成熟DC，并可在体外诱导出针对胃癌细胞的特异性杀伤T淋巴细胞，对胃癌细胞有明显的杀伤作用，并伴有高水平的INF-γ分泌。     

抗原负载树突状细胞刺激细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期胃癌的临床观察

目的探讨抗原负载树突状细胞(DC)刺激细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗晚期胃癌的临床疗效及毒副反应。方法采集晚期胃癌患者外周血单个核细胞,洗涤后在体外培养成CIK,同时培养DC,并给予负载抗原,7 d后将DC与CIK共培养,14 d后回输体内,观察疗效。结果CIK治疗晚期胃癌可明显减轻症状,改善患者免疫功能,而无明显副反应。结论CIK治疗可作为晚期胃癌常规治疗的有效辅助手段。     

血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

目的采用自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者的外周血单个核细胞,经体外培养扩增出树突状细胞(dendritic cell DC)/细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell CIK),应用DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤患者,观察其不良反应。方法采集10例血液肿瘤自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞,在体外经GM-CSF、IL-4、TNF-α等诱导产生DC,经IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2等诱导产生CIK,观察其细胞形态及临床应用的不良反应并分析其细胞免疫表型。结果培养产生形态学典型的DC/CIK。诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示CD80、CD83、CD86、CD1a等阳性细胞比率大幅上升。CIK随着培养时间的延长,CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性细胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK细胞免疫治疗过程中,3例患者DC注射部位出现轻微疼痛,可自行缓解。2例患者输注CIK后出现低热,持续时间2～6h,可自行消退。4例患者输注完CIK后出现乏力,约2h可自行缓解。结论自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞对DC/CIK的培养不受影响。DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者,安全性好,不良反应少。     

自体与异体CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与异体CIK细胞的抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导CIK细胞,以自体细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果异体CIK细胞增殖能力明显高于自体CIK细胞(P<0.01),CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比率较相同条件下自体CIK细胞组显著增多(P<0.05),培养7 d,上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比自体CIK细胞培养的水平高(P<0.05),对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于自体CIK细胞(P<0.01)。结论异体CIK细胞比自体CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

DC、CIK治疗在急性白血病中的临床应用与疗效观察

【摘要】目的 通过体外培养获得树突状细胞（DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）,应用于急性白血病（AL）患者体内白血病微小残留病（MRD）的清除,探讨其临床应用方法、疗程、安全性和疗效评估。方法 34例共45例次AL患者均通过血细胞单采获得外周血单个核细胞,以细胞因子体外诱导获得DC和CIK,分别行腹股沟淋巴结区皮下注射和静脉输注;治疗过程中观察不良反应及安全性;治疗前、中、后期进行T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子、微小残留病灶、骨髓涂片和融合基因等方面检测,进行疗效评估。结果 DC、CIK治疗不良反应少,安全性好,偶见发热等症状,可自行消退;所有患者治疗结束后均处于血液学和遗传学缓解状态,T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子和微小残留病灶检测取得满意结果。结论 DC、CIK治疗AL安全有效,副作用少,患者易于耐受,短期疗效肯定,为AL患者MRD的清除以至AL的治愈提供了一条新的有效途径,对其远期疗效需扩大例数进一步观察。 【关键词】 树突状细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞;急性白血病;白血病残留病灶     

负载抗原DC与CIK共培养对富集培养乳腺癌CTCs杀伤作用研究

[Abstract]ObjectiveTo study the kill activity of the whole tumor cell antigen (Ag) pulsed dendritic cell (DC) coculture with cytokine induced killer cell (CIK) for breast cancer circulating tumor cells (CTCs).Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from breast cancer patients with CTCs using a blood cell separator instrument. The epidermal cell adhesion molecule (EpCAM ) (+) breast cancer CTCs enriched by MACS were cultured in vitro. The nested RT-PCR, cell immunofluorescence imaging (CK8/18), and immunohistochemistry (CK8/18and CK19) methods, were used for the detection and identification of the cells. EpCAM (-) cells were routinely induced to DC and CIK, which were grouped into Ag-DC-CIK group, DC-CIK group, DC group and CIK group. The cytotoxic activity of co-cultured DC-CIK against breast cancer CTCs was detected by flow cytometry and MTT assay. The cell morphology was observed by light microscopy and transmission electron microscopy.ResultsThe target band of CK19mRNA can be detected by nested RT-PCR. The expressions of CK8/18and CK19of EpCAM (+) cells in vitro were positive by immunofluorescence staining and immunohis?tochemical staining. The proliferative activity of co-cultured DC-CIK was higher than that of CIK (P＜0.001). The positive rates of CD1α+, CD83+CD86+, CD83+CD11C+, CD86+CD11C+DCs and CD3+CD8+, CD3+CD56+CIKs were significantly higher in Ag- DC- CIK group than those of DC- CIK group, DC group and CIK group (P＜0.05). The apoptosis of breast cancer CTCs was induced in Ag-DC-CIK, DC-CIK and CIK3groups, and apoptotic rates were (56.83±3.07)%,(31.43±1.77)% and (24.70±1.51)%, showing significant differences between them (P＜0.05). Transmission electron microscopy showed the typical micro-structure of breast cancer CTCs induced apoptosis.ConclusionMACS in combination with cell immunological methods can improve significantly the detective sensitivity of breast cancer CTCs. The co-cultured Ag-DC-CIK is highly effective immune cells,which shows a high er proliferation and cytoxicty against breast cancer CTCs. This may be used as a clinically immunotherapy means of anti-breast cancer recurrence and metastasis.     

CD44v6修饰DC融合瘤苗抗胰腺癌作用的研究

目的：探讨CD44v6修饰树突状细胞（DC）融合瘤苗抗胰腺癌的作用,为肿瘤免疫治疗提供实验依据及理论基础。方法：（1）取小鼠骨髓细胞在细胞因子GM—CSF、IL-4、TNF—α的诱导下体外大量扩增DC细胞;（2）在PEG的作用下．进行DC和小鼠胰腺癌细胞（TD2）的融合,并利用HAT／HT系统筛选出纯净融合细胞株;（3）Lipofectamine 2000的介导下,将pBud—CD44v6转染到肿瘤融合细胞中表达;（4）荷瘤小鼠接种融合瘤苗,测量肿瘤大小。结果：成功构建了CD44v6修饰的D/TD2融合瘤苗：免疫组肿瘤体积明显小于对照组。结论 小鼠骨髓来源的DC在PEG作用下成功与TD2细胞融合,同时以CD44v6加以修饰,且融合细胞可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗胰腺癌作用。     

CD_(137)对宫颈癌患者CIK细胞功能调节的实验研究

目的探讨CD137mAb对宫颈癌患者CIK细胞的功能调节。方法分离宫颈癌患者外周血单个核细胞(PBMCs),常规CIK培养体系中加入CD137mAb为实验组(CD137-CIK组),同时对照组加入鼠IgG1同型对照(IgG1-CIK组)。动态观察CIK细胞体外增殖;流式检测CIK细胞凋亡率、细胞表型及CD3+CD56+细胞内因子的表达;LDH酶释放法检测CIK细胞杀伤活性。结果两组CIK细胞均有很强的增殖活性,实验组细胞浓度最高达(20.92±3.57)×106/mL,对照组为(14.02±2.68)×106/mL(P<0.05);第21天实验组和对照组CD3+CD56+细胞比例分别达到(35.48±5.46)%和(25.12±4.18)%(P<0.05);CD137-CIK组细胞凋亡坏死率明显低于IgG1-CIK组;实验组CIK细胞体外杀伤宫颈癌HeLa细胞株活性明显高于对照组(P<0.05);流式检测CD137-CIK组中CD3+CD56+细胞内IL-2,IFN-γ表达上调,IL-4,IL-10表达下调。结论 CD137mAb介导的共刺激信号可以显著提高宫颈癌患者CIK细胞的体外增殖活性和抗瘤作用。     

特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤多途径抑瘤作用的研究

目的探讨特异性抗原致敏的树突状细胞(dentritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞对B16黑色素瘤的作用。方法采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共同培养,分析其免疫表型,计算抑瘤率;流式细胞(FCM)检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数(apoptosis Index,AI)、细胞增殖指数(proliferation Index,PI)的变化;透射电镜观察形态学变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的杀伤力。结果特异性抗原致敏的DC-CIK细胞组抑瘤率高于DC-CIK组和CIK组;FCM检测G0/G1期细胞比率、AI显著升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显著下降;特异性抗原致敏的DC-CIK细胞组杀伤活性明显升高(P<0.05)。结论特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤的抑瘤作用明显高于DC-CIK细胞和单纯CIK细胞。     

脐血浆培养的脐血树突状细胞对胃癌细胞的特异杀伤作用

目的尝试用脐血浆代替胎牛血清培养脐血树突状细胞（DCs）,并使之负载胃癌抗原,观察其对胃癌细胞的特异杀伤作用。方法分离脐血单个核细胞（CBMCs）并在含10％同源脐血浆的培养体系中诱导培养,部分细胞加入胃癌冻融抗原冲击。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD1a和CD83表达,MTT法检测DCs体外刺激淋巴细胞增殖活性,LDH法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对胃癌及肝癌细胞的细胞毒作用。结果CBMCs能分化为表型正常的未成熟DCs,并进而吞噬胃癌细胞冻融抗原成熟,刺激淋巴细胞增殖并诱导对胃癌细胞株特异的CTLs毒性。结论脐血浆培养的脐血DCs能有效捕获胃癌冻融抗原,激发针对胃癌细胞的特异杀伤效应。本实验采用的DCs制备方法具有方法简单、成本较低、瘤苗制备时间较短等优点。