罗格列酮抑制AGEs诱导的人肾小球系膜细胞β1-整合素的表达

目的 观察罗格列酮对糖基化终产物(AGEs)干预的人肾小球系膜细胞(HRMC)β1-整合素表达以及细胞外基质(ECM)成分Ⅳ型胶原分泌的影响.方法 用葡萄糖和牛血清白蛋白制备糖基化终产物(AGE-BSA),用不同浓度的罗格列酮(1.0、10.0、100.0 μmol/L)和AGE-BSA共同干预以及AGE-BSA单独干预(AGEs组)HRMC.RT-PCR法测定细胞β1-整合素mRNA水平;Western blot法检测βl-整合素蛋白表达;放射免疫分析法测定细胞培养上清液Ⅳ型胶原含量.结果 与AGES组相比,各浓度罗格列酮均能下调由AGE-BSA诱导的HRMC β1-整合素mRNA和蛋白表达的升高,并抑制培养上清液Ⅳ型胶原的分泌(P<0.05).结论 罗格列酮可能通过抑制AGEs引起的HRMC β1-整合素mRNA和蛋白表达及Ⅳ型胶原含量的升高,发挥一定的肾脏保护作用.     

罗格列酮对血管平滑肌细胞血管紧张肽Ⅱ受体2表达的影响

目的:观察罗格列酮对血管紧张肽Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张肽Ⅱ受体2(AT_2R)mRNA和蛋白表达的影响及其机制。方法:1μmol·L~(-1) AngⅡ孵育体外培养大鼠VSMCs 6h,然后随机分成7组,另设空白对照组。其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol·L~(-1)罗格列酮干预12h;另3组加入30μmol·L~(-1)的罗格列酮分别再干预6、12、24h;余1组为AngⅡ模型组。采用RT- PCR和免疫组织化学方法检测VSMCs AT_2R mRNA及蛋白的表达水平。结果:空白对照组AT_2R mRNA和蛋白表达量为[(57±s5)％,1.094±0.012],AngⅡ可下调AT_2R mRNA及蛋白的表达[(41±4)％,0.91±0.05](P<0.01,P<0.05);与AngⅡ组相比,罗格列酮20、30、50μmol·L~(-1)干预12h或30μmol·L~(-1)罗格列酮再干预6、12、24h均能使AT_2R mRNA和蛋白的表达明显上调[(63±6)％,1.18±0.04;(94±10)％, 1.35±0.03;(110±12)％,1.58±0.03;(40±4)％,1.23±0.03;(57±6)％,1.372±0.023;(90±10)％,1.64±0.03](P<0.05,P<0.01)。结论:基础状态下,体外培养的大鼠VSMCs AT_2R少量表达, AngⅡ下调AT_2R mRNA及蛋白的表达;一定浓度范围内,罗格列酮可剂量、时间依赖性地上调AngⅡ诱导的大鼠VSMCs AT_2R mRNA和蛋白的表达。     

吡格列酮和厄贝沙坦对糖基化终产物诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察吡格列酮和厄贝沙坦对糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,6～10代的细胞用于实验,糖基化终产物(50,100,200,400 mg·L~(-1))干预血管平滑肌细胞不同时间(0,8,16,24,48 h)后,分别用氨基胍(阳性对照组)、吡格列酮、厄贝沙坦与200 mg·L~(-1)基化终产物共同孵育24 h,四甲基偶氮唑盐微量酶比色(MTT)法检测血管平滑肌细胞增殖。结果：各浓度的糖基化终产物对血管平滑肌细胞作用8 h,细胞增殖不明显,200 mg·L~(-1)糖基化终产物作用48 h,细胞增殖最明显；氨基胍、吡格列酮、厄贝沙坦均能抑制糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖(P＜0．05)。结论：吡格列酮与厄贝沙坦可明显抑制糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖。     

姜黄素通过上调PPARγ抑制糖基化终末产物诱导软骨细胞分泌TNF-α及MMP-13

目的在体外培养的家兔软骨细胞模型上,观察姜黄素(curcumin)对糖基化终末产物(AGEs)诱导的软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响,并探讨其相关机制是否与姜黄素上调PPARγ有关。方法采用real-time PCR方法检测TNF-α、MMP-13、PPARγmRNA的表达量;试剂盒方法检测CAT、SOD活性及MDA水平,荧光探针法检测ROS水平;Western blot检测PPARγ蛋白含量;DNA-binding法检测PPARγ活性。结果 AGEs(100μg·mL~(-1))与软骨细胞共孵育48 h后,TNF-α及MMP-13 mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.05),50μmol·L~(-1)的姜黄素与软骨细胞预孵育2 h后,可以显著抑制由AGEs诱导的TNF-α及MMP-13 mRNA增多,拮抗由AGEs所致细胞CAT、SOD活性降低及MDA、ROS水平增高(P<0.05);给予PPARγ特异性抑制剂GW9662 10μmol·L~(-1)预处理后,可以显著拮抗姜黄素对AGEs诱导软骨细胞损伤及氧化应激的保护作用;姜黄素显著上调AGEs诱导的PPARγ活性降低,伴随PPARγ相应mRNA及蛋白表达水平的升高。结论姜黄素可能通过上调PPARγ从而降低ROS水平,进而抑制由AGEs诱导的TNF-α和MMP-13表达增多,保护软骨细胞的功能。     

钠/氢交换蛋白1在糖基化终末产物诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞表型转换中的作用

目的在体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMCs)模型上,观察钠/氢交换蛋白1(NHE1)选择性抑制剂cariporide对糖基化终末产物(AGEs)诱导VSMCs表型转化的作用并探讨相关机制。方法采用CCK8检测VSMCs细胞增殖,Transwell试验检测细胞迁移情况;BCECF荧光探针检测细胞内pH值及NHE1活性;Western blot检测NHE1、α-SMA、SM22α及OPN蛋白表达。结果 NHE1选择性抑制剂cariporide及Rho激酶(ROCK)抑制剂Y-27632可显著拮抗AGEs诱导的VSMCsα-SMA、SM22α蛋白表达降低及OPN蛋白表达的增多,抑制VSMCs转换为合成表型(去分化表型),从而抑制AGEs诱导的VSMCs的增殖和迁移;同时Y-27632可显著抑制AGEs诱导的细胞内pH值升高,NHE1的活性及蛋白表达。结论该研究结果提示NHE1活化在AGEs诱导VSMCs表型转化中可能起重要作用,同时AGEs调节NHE1活化的机制可能与ROCK相关。     

氟伐他汀对糖基化终末产物诱导肾小管细胞转分化及ERK1/2信号通路的影响

目的观察氟伐他汀对糖基化终末产物(AGEs)诱导肾小管上皮细胞(HKC)转分化及ERK1/2信号通路的影响。方法将肾小管上皮细胞(HKC)分为对照组、AGEs刺激组、AGEs加氟伐他汀组和AGEs加ERK1/2阻断剂PD98059组,采用免疫细胞化学检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况;Western blot检测α-SMA、E-钙黏着糖蛋白(E-cadher-in)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、细胞外信号调节酶1和2(ERK1/2)及其磷酸化蛋白(p-ERK1/2)的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的分泌;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-SMA和E-cadherin mRNA的表达。结果与对照组相比,AGEs组肾小管细胞α-SMA和Col I蛋白表达明显上调,细胞培养上清中TGF-β1含量增加,α-SMA mRNA的表达增加,而E-cadherin蛋白和mRNA表达下调;AGEs刺激细胞15minp-ERK1/2表达明显增强,1h达到高峰。PD98059和氟伐他汀能够抑制AGEs刺激引起的HKC细胞α-SMA和ColI的表达及ERK1/2的磷酸化;减少TGF-β1的含量;下调AGEs刺激引起的HKC细胞α-SMA mRNA的表达;同时能够逆转AGEs刺激引起的HKC细胞E-cadherin蛋白和mR-NA的下调表达。结论氟伐他汀抑制AGEs诱导肾小管上皮细胞转分化和胶原I的合成可能是通过抑制ERK1/2信号通路活化实现的。     

细胞因子信号传导抑制蛋白1对糖基化终末产物诱导的肾小管细胞转分化的影响

目的观察细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS-1)对糖基化终末产物(AGEs)诱导肾小管上皮细胞(HKC)转分化及JAK/STAT信号通路的影响。方法体外培养人肾小管上皮细胞(HKC),应用脂质体2000分别转染pCR3.1/SOCS-1表达质粒和pCR3.1空质粒载体,G418筛选阳性克隆。分别采用白蛋白和AGEs进行刺激。采用Western印迹检测SOCS-1、α-SMA、E-钙黏着糖蛋白(E-cadherin)、Ⅰ型胶原(collagenI,ColI)、信号转导和转录活化因子1、3(STAT1、STAT3)及其磷酸化蛋白(p-STAT1、p-STAT3)的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的分泌;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-SMA和E-cadherin mRNA的表达。结果与对照组相比,AGEs组肾小管细胞α-SMA和ColI蛋白表达明显上调,细胞培养上清中TGF-β1含量增加,α-SMA mRNA的表达增加,而E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。SOCS-1过表达能够抑制AGEs刺激引起的HKC细胞α-SMA和ColI的表达及STAT1和STAT3的磷酸化,减少TGF-β1的含量,下调AGEs刺激引起的HKC细胞α-SMA mRNA的表达,同时能够逆转AGEs刺激引起的HKC细胞E-cadherin蛋白和mR-NA的下调表达。结论SOCS-1过表达抑制AGEs诱导的肾小管上皮细胞转分化可能是通过抑制JAK/STAT信号通路活化实现的。     

伊贝沙坦对人肾系膜细胞β1-整合素表达及Ⅳ型胶原分泌的影响

目的 探讨伊贝沙坦对糖基化终产物(AGEs)干预下人肾系膜细胞(HRMC)β1-整合素表达以及胞外基质(ECM)成分Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)分泌的影响.方法 用糖基化终产物-牛血清白蛋白(AGE-BSA)干预HRMC(AGE-BSA组),用不同浓度的伊贝沙坦与AGE-BSA共同干预HRMC48 h(伊贝沙坦干预组).RT-PCR法测定细胞β1-整合素mRNA水平;Western b1ot法检测β1-整合素蛋白表达;放射免疫分析法测定细胞培养上清Ⅳ-C含量.结果 与AGE-BSA组相比,伊贝沙坦干预组能下调由AGE-BSA诱导的HRMCβ1-整合素mRNA和蛋白表达的升高,并抑制培养上清Ⅳ-C的分泌(P<0.05).结论 伊贝沙坦可能通过抑制AGEs引起的上述改变而发挥其肾脏保护作用.     

GLP-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞凋亡的保护作用研究

目的研究胰高血糖素样肽素-1(glucogon like pep tide-1,GLP-1)对晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导H9C2心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法体外培养H9C2细胞,实验分为4组:正常对照组、100 mg·L~(-1)AGEs试验组、AGEs(100 mg·L~(-1))+GLP-1(10 nmol·L~(-1))组、AGEs(100 mg·L~(-1))+NAC(5 mmol·L~(-1))组,处理24 h。通过CCK-8比色法检测细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态,双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜摄片观察细胞内活性氧(ROS)水平;RT-PCR法测定Bax、Bcl-2 mRNA基因的表达;运用Hoechst 33258检测试剂盒及流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达量。结果与正常组相比,100 mg·L~(-1)AGEs组降低H9C2细胞生存率,活性氧(ROS)生成量增加;与AGEs组相比,AGEs+GLP-1组细胞生成率提高,活性氧(ROS)生成量减少。与正常组相比,AGEs组促凋亡蛋白Bax表达增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2减少,细胞凋亡率升高;AGEs+GLP-1组较AGEs组下调促凋亡蛋白Bax,上调凋亡抑制蛋白Bcl-2,细胞凋亡率减少。结论 GLP-1对AGEs诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用,其保护机制与减少活性氧(ROS)有关。     

糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶表达的影响

目的 观察内皮细胞糖基化终产物受体(RAGE)的表达以及糖基化终产物(AGEs)对基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响.方法 将人脐静脉内皮细胞随机分为三组:AGEs 200 μg/ml+α-硫辛酸200μmol/L药物干预组(A组)、AGEs 200 μg/ml作用组(B组)、正常对照组(C组).流式细胞术检测细胞表面RAGE表达,RT-PCR分析MMPs的表达变化.结果 内皮细胞表面RAGE呈高表达.与C组相比,B组MMP-1、MMP-7、MMP-9、MMP- 11和MMP-12 mRNA表达上调,而A组能下调AGEs作用下的内皮细胞MMPs的表达.结论 α-硫辛酸能抑制AGEs与RAGE相互作用诱导的MMPs表达,从而有助于减少因动脉斑块破裂引起的急性血管事件的发生.     

氯沙坦对血管平滑肌细胞富含半胱氨酸蛋白61的影响

目的探讨氯沙坦对血管平滑肌细胞富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)的影响。方法贴块法培养大鼠血管平滑肌细胞,分别给予不同浓度血管紧张肽Ⅱ(ATⅡ)和氯沙坦,采用半定量逆转录聚合酶链反应及Western blotting检测不同处理组平滑肌细胞CYR61 mRNA和蛋白表达。采用酶联免疫吸附技术检测平滑肌细胞培养介质中CYR61含量的变化。结果10~(-6)/10~(10) mol·L~(-1)ATⅡ呈剂量依赖性地增加平滑肌细胞内CYR61蛋白及其mRNA表达水平,增高培养介质中CYR61含量(P<0.01)。10~(-5)～10~(-7)mol·L~(-1)氯沙坦预处理组中,ATⅡ刺激的平滑肌细胞CYR61蛋白及其mRNA表达水平及培养介质中CYR61含量明显减低(P<0.01)。结论氯沙坦可拮抗ATⅡ所致的平滑肌细胞内CYR61的表达与分泌。     

罗格列酮对阿霉素肾病大鼠足细胞nephrin表达的影响

目的建立阿霉素肾病模型,探讨罗格列酮对阿霉素肾病大鼠足细胞nephrin的表达的影响。方法21只大鼠随机分为3组。阿霉素肾病组和罗格列酮组大鼠予0.1%阿霉素溶液7 mg·kg~(-1)一次性尾静脉注射,罗格列酮组次日予罗格列酮5 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,每日1次,共8 wk。另外2组每日予等量自来水灌胃。检测各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血脂、肾功能及肾脏病理改变,并检测肾组织nephrin和TCFβ_1的表达。结果给药后2、4、6、8 wk,罗格列酮组大鼠24 h尿蛋白定量明显低于阿霉素肾病组(P<0.05),8 wk时其血清清蛋白高于阿霉素肾病组[(26.7±s 2.6)g·L~(-1)vs(21±4)g·L~(-1),P<0.05],血三酰甘油和胆固醇水平低于阿霉素肾病组(P<0.05)。与阿霉素肾病组比较,罗格列酮组大鼠肾组织中nephrin蛋白表达增高19%(P<0.05),而TGFβ_1蛋白表达明显降低(P<0.01),肾脏病理损害也明显减轻。结论罗格列酮可上调阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin表达,减少尿蛋白排泄,抑制其TGFβ_1表达,从而减轻肾组织病理损害。     

赤芍801对小鼠巨噬细胞COX-1和COX-2活性、mRNA及蛋白表达的影响

目的研究赤芍801(propyl gallate,PrG)对环氧酶(cy-c looxygenase,COX)活性、mRNA及蛋白表达的影响。方法采用基于小鼠腹腔巨噬细胞的COX-1和COX-2体外筛选模型,用钙离子导入剂(calc ium ionophore A23187)短时刺激小鼠腹腔巨噬细胞,测定培养上清液中的6酮--前列腺素F1α(6-keto-PGFlα)的量反映COX-1活性;用脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)长时间刺激细胞,测定培养上清液中的前列腺素E2(PGE2)的量反映COX-2活性。半定量RT-PCR法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mRNA表达的影响。W estern b lot法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2蛋白表达的影响。结果PrG体外10,5μmol.L-1浓度下不影响6-keto-PGFαl生成(P>0.05),而在1,0.5,0.1,0.05μmol.L-1浓度下则诱导6-keto-PGF1α生成(P<0.01),并呈较好的剂量依赖性。PrG体外1,10μmol.L-1可抑制PGE2生成(P<0.05)。PrG不同浓度对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mR-NA表达无明显影响。PrG(100,10,1μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。结论在0.05~10μmol.L-1浓度范围内,PrG低浓度时促进6-keto-PGF1α生成,高浓度时抑制PGE2生成,提示其高浓度时抑制COX-2,低浓度时激活COX-1;不同浓度PrG对COX-1、COX-2 mRNA表达均无明显影响。PrG(1~100μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。     

西替利嗪干预组胺诱导的真皮成纤维细胞IL-8和MCP-1产生

目的　探讨真皮成纤维细胞组胺H1 受体(histamineH1 receptor,H1R)表达及西替利嗪(cetirizine,CET)对组胺(histamine,HIS)诱导炎症因子的干预作用,寻找CET抗皮肤过敏炎症的作用靶点。方法　采用RT- PCR和免疫组化技术检测真皮成纤维细胞H1RmRNA和蛋白表达;用HIS处理细胞为模型组,ELISA检测HIS诱导IL 8和MCP -1的蛋白分泌及CET的干预作用。结果　真皮成纤维细胞有H1RmRNA和蛋白表达; 10-6 ~10-4 mol·L-1 HIS显著地诱导了真皮成纤维细胞IL -8蛋白分泌(P<0 .05vs对照组),10-5 mol·L-1 HIS明显地诱导了MCP 1分泌(P<0 .01vs对照组),加入10-6、10-5 mol·L-1 CET共同培养24h,抑制了HIS诱导的IL- 8和MCP -1表达(P<0 .05vs模型组)。结论　CET可能通过抑制真皮成纤维细胞趋化因子的表达而发挥抗皮肤过敏炎症作用。     

杨梅素对淋巴细胞活化及增殖的影响

目的研究杨梅素(myricetin)对小鼠T细胞活化及增殖的影响,探讨其作为免疫调节药物开发的可能性并提供相关实验依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术,流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+T细胞CD69表达的影响;采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响,采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2mRNA表达的影响。采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响。结果杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达,并能抑制淋巴细胞增殖反应,同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用。结论杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用。     

Advanced glycation end products promote human aortic smooth muscle cell calcification in vitro via activating NF-κB and down-regulating IGF1R expression

Aim:

To investigate the effects of advanced glycation end products (AGEs) on calcification in human aortic smooth muscle cells (HASMCs) in vitro and the underlying mechanisms.

Methods:

AGEs were artificially prepared. Calcification of HASMCs was induced by adding inorganic phosphate (Pi, 2 mmol/L) in the media, and observed with Alizarin red staining. The calcium content in the supernatant was measured using QuantiChrome Calcium Assay Kit. Expression of the related mRNAs and proteins was analyzed using real-time PCR and Western blot, respectively. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was used to detect the binding of NF-κB to the putative IGF1R promoter.

Results:

AGEs (100 μg/mL) significantly enhanced Pi-induced calcification and the levels of osteocalcin and Cbfα1 in HASMCs. Furthermore, the treatment decreased the expression of insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Over-expression of IGF1R in HASMCs suppressed the AGEs-induced increase in calcium deposition. When IGF1R expression was knocked down in HASMCs, AGEs did not enhance the calcium deposition. Meanwhile, AGEs time-dependently decreased the amounts of IκBα and Flag-tagged p65 in the cytoplasmic extracts, and increased the amount of nuclear p65 in HASMCs. In the presence of NF-κB inhibitor PDTC (50 μmol/L), the AGEs-induced increase in calcium deposition was blocked. Over-expression of p65 significantly enhanced Pi-induced mineralization, but suppressed IGF1R mRNA level. Knockdown of p65 suppressed the AGEs-induced increase in calcium deposition, and rescued the IGF1R expression. The ChIP analysis revealed that NF-κB bound the putative IGF1R promoter at position −230 to −219 bp. The inhibition of IGF1R by NF-κB was abolished when IGF1R reporter plasmid contained mutated binding sequence for NF-κB or an NF-κB reporter vector.

Conclusion:

The results demonstrate that AGEs promote calcification of human aortic smooth muscle cells in vitro via activation of NF-κB and down-regulation of IGF1R expression.