两种全基因组扩增技术对单根毛发DNA检验效能的研究

目的研究简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)对单根毛发检验的法医学价值。方法以三种方法对单根毛发样本进行STR分型,第一种方法直接对提取DNA用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,第二种和第三种方法是先对提取的DNA样本分别进行DOP-PCR和PEP-PCR扩增处理,然后对其产物用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,对两种方法的效能进行比较评价。结果 DOP-PCR和PEP-PCR技术增加了单根毛发STR分型的准确率和信息量。结论 DOP-PCR和PEP-PCR技术对单根自然脱落毛发的检验具有实用价值。     

直接扩增技术在接触性检材 DNA检验中的应用

目的：将DNA直接扩增技术引入案件现场不同的接触性检材的检验中,构建有效的接触性DNA的生物检材的检验方法。方法采用剪取、擦拭等方法对手套、烟蒂、衣服、饮料瓶、吸管及残缺指纹等检材进行取样,采用DNA直接扩增技术获得短串联康复序列（short tandem repeat ,STR）分型。结果 DNA直接扩增技术在5种不同检材中检出的基因型均为单一个体来源,其对手套、烟蒂、衣服、饮料瓶和吸管、残缺指纹检材的成功率分别为90％、100％、70％、90％和60％,平均成功率在70％以上。分别对5种检材多处取点样品进行平行扩增,手套、烟蒂检材3个点位成功率均在90％以上;饮料瓶、吸管3个点位的成功率达80％～90％;衣服3个点位的成功率在60％～70％;残缺指纹3个点位的成功率在50％～60％。结论 DNA直接扩增技术对接触性DNA检材检验具有较高的有效应,其结果可靠,重复性强。     

线粒体单核苷酸多态性复合扩增体系在疑难检材中的法医学应用研究

目的应用线粒体单核苷酸多态性(SNPs)的复合PCR扩增体系应用于法医检验案件中的陈旧血痕、脱落细胞检材、腐败降解检材及骨组织等疑难检材,为解决法医学检验疑难检材的难题提供一种新的方法。方法用IdentifilerTM试剂盒进行目前使用的STR分型及已建立的18个线粒体SNPs(16个位于编码区和2个控制区)位点复合扩增毛细管电泳荧光检测体系,并行对照检验案件中的陈旧血痕、脱落细胞、腐败肌肉、软骨以及牙齿、骨等各种疑难检材。结果对于上述检材,STR与线粒体SNPs的检验成功率均达到80%以上,线粒体SNPs高于STR。对于高度腐败的肌肉及软骨、骨骼检材,线粒体SNPs的检验成功率明显高于STR。结论所建立的线粒体SNPs复合PCR扩增体系在疑难检材检验中具有良好的应用前景。     

微量接触DNA的浓缩与回收

目的对纯化后的微量DNA进行进一步浓缩,提高DNA检验成功率。方法将30ml（约600pg）纯化后的微量DNA,分别采用Amicon离心超滤管和DNAClean＆ConcentratorTM-5试剂盒进行浓缩回收,用Identifiler试剂盒进行PCR扩增及分型检测,比较STR分型图谱的平均峰高、峰面积和等位基因丢失率。检验24枚白纸上的汗潜指纹,比较浓缩前后的检验效果。结果经过Amicon离心超滤管回收后,STR分型平均峰高85．3RFU,平均峰面积为1130．8,等位基因丢失率为66．13％。经过DNAClean ＆ ConcentratorTM-5试剂盒回收后,STR分型平均峰高147．5RFU,平均峰面积为1960．2,等位基因丢失率为35．14％。汗潜指纹的DNA检验通过DNAClean＆concentralor^TM-5试剂盒纯化浓缩,获得有效分型的数量由浓缩前的9枚提高为20枚。结论DNAClean＆C0ncentrator^TM-5试剂盒可以明显提高微量DNA检材的检验成功率,效果优于Amicon离心超滤管。对白纸上的指纹,DNAClean＆Concentrator^TM-5试剂盒浓缩后检验成功率升高。     

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。     

短片段重复序列复合扩增技术在亲子鉴定中的运用

多位点复合扩增短片段重复序列（Short Tandem Repeat,STR）技术是运用最为广泛的人类遗传认定系统,其原因有以下几个方面：（1）可以对部分降解的或陈旧性生物标本中的DNA进行特异性扩增;（2）与DNA指纹技术、AMP-PLP技术和RFLP技术相比,STR技术仅需要1～5 ng的模板DNA;（3）可在同一PCR扩增管中加入3对以上的STR引物,在同一条件下进行扩增;（4）扩增结果易于分析,不需要放射性标记;（5）结果分析时,由于采用了等位基因Ladder,简化了结果的分析步骤,实现了结果分析的标准化,使得不同实验室的认定结果有了可比性,同时也为结果分析的自动化奠定了基础.于1998年初开始把这项技术运用于实际案例中,现将运用情况报告如下.     

用Chelex-100方法提取肋软骨DNA105例

目的研究尸体所处环境、死亡时间的条件下,用Chelex-100方法提取肋软骨DNA。方法对案件中不同条件腐败尸体，采用Chelex-100方法提取肋软骨DNA，进行PCR扩增及STR分型。结果提取肋软骨均可获得STR分型。结论肋软骨是法医检案中的一类具有实用价值的检材。     

Y-STR分型在侦破案件中的应用

目的为Y-STR基因分型技术应用于案件侦破提供依据。方法对1例系列抢劫强奸盗窃独居老年妇女案和1例抢劫杀人案进行回顾性分析。结果案例1中梁姓家族男性的Y-STR基因分型与嫌疑人一致,经DNA基因分型测序检验结果证实梁某检材的STR基因分型与案件的遗留精斑基因分型一致。案例2中根据现场路面提取的生物检材经过Y-STR基因分型测序检验,被认定为死者潘某的同宗潘姓男子所留,对本村潘姓村民的生物检材样本经DNA基因分型测序检验证实潘某某的STR基因分型与现场犯罪嫌疑人遗留生物检材的基因分型一致。结论 Y-STR分型技术可以为案件侦破指明侦查方向,为案件侦破提供重要科学技术支撑。     

4个Y-miniSTR基因座荧光标记复合扩增体系的建立

目的:构建DYS456,DYS392,DYS439,Y-GATA-H4等4个Y-mini STR基因座复合扩增体系,评价其检测敏感度、数据库兼容性和对降解检材的分型能力。方法:设计4个Y-mini STR的引物,用FAM、JOE、ROX、TAMRA分别标记其上游引物,构建复合扩增体系。利用本体系的引物扩增稀释过的Y23试剂盒的ladder,制备等位基因分型标准物。比较该体系与Promega Power PlexY23试剂盒在普通检材、降解检材的分型能力、敏感度和分型结果。结果:同一样本体系分型结果和商业化试剂盒Y23 STR分型结果相同,4个Y-mini STR复合扩增体系和对降解检材的分型成功率更高,敏感度一致,具有数据库兼容性。结论:本研究中的4个Y-mini STR复合扩增体系对降解检材的检测具有应用价值,敏感性较好,具有数据库兼容性,可以作为对降解检材分型时商业化试剂盒的补充。     

微量口腔粘膜脱落细胞检材STR位点的法医学检测分型

微量生物性检材的DNA多态性检测分型是法医物证学研究热点和难点。随着STR PCR技术出现 ,除了血痕、混合斑等微量检材 ,指纹、汗渍、头屑等特殊极微量生物性检材已经进入法医学科研应用领域。口腔粘膜脱落细胞多为有核的鳞状上皮细胞 ,含有完整的二倍体的核DNA基因组 ,利用该类     

用母体外周血中胎儿游离DNA检测胎儿SRY基因的研究

目的探索从孕妇外周血浆中检测胎儿躲y基因的高灵敏性及高准确性方法。方法应用PcR、实时荧光定量PcR、PEP—PcR技术,检测33例妊娠8～14周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的脓y基因。组织标本躲y基因检测结果作为性别判定的标准。结果33例孕妇血浆标本检测职y基因,普通PcR检出的灵敏性为58．82％,特异性100％。PEP—PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。荧光定量PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。结论PEP—PCR技术和荧光定量PcR技术均可以提高胎儿游离DNA检测的灵敏度及准确性．可用于进一步染色体疾病的无创性产前筛查研究。     

两种前处理方法对粘液型宫颈HPV分型结果的比较

目的 研究2种前处理方法对粘液型标本HPV DNA杂交结果的影响,为进一步提高临床检验质量和改进检测技术提供理论依据.方法 收集100例妇科门诊患者粘液型宫颈脱落细胞标本,分别采用常规方法(生理盐水震荡法)和蛋白酶K消化法对脓性粘液型标本进行前处理,应用核酸分子快速导流杂交技术进行21种HPV亚型感染检测.研究不同前处理方法对HPV DNA浓度、纯度和分型结果的影响.结果 ①常规方法处理后所抽提的DNA纯度、含量分别为1.63±0.71和(96.35±13.15)μg/ml,蛋白酶K消化法处理后所抽提的DNA纯度、含量分别为1.80±0.52和(105.14±18.65)μg/ml,蛋白酶K消化法处理后检测的DNA纯度和含量分别高于常规法(P＜0.01).②常规法检测出现PCR反应抑制物的例数为4例,而蛋白酶K消化法则为0例.③常规法和蛋白酶K消化法HPV分型的总阳性率、单一感染率、多重感染率分别为28.0％、23.0％、5.0％和32.0％、26.0％、6.0％,两法一致性检验Kappa=0.888,结果具有较好的一致性.结论 基于蛋白酶K消化法的HPV检测,对粘液型标本可获得质量较好的HPV DNA,无核酸丢失和污染,分型结果满意,可以有效去除PCR反应抑制物,操作简便,适合临床检验应用.     

AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。     

荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值比较

目的比较荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值。方法选取该院2012年1月—2013年12月收治的126例符合入选标准的HBV患者,分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平,对HBV-DNA基因分型结果进行比较分析。结果 126份样本只检测出3种基因分型（B型、C型、B/C混合型）,其中B型占明显优势。荧光定量分型PCR法B/C混合型检出率明显高于直接测序法（P〈0.001）;一致性检验表明两种检测方法的一致性较好（Kappa〉0.75）;TA克隆结果与荧光定量分型PCR法一致。结论荧光定量分型PCR法检测HBV-DNA水平应用价值较直接测序法高,值得临床推广应用。     

抗凝剂对定量检测乙型肝炎病毒DNA的影响

目的探讨用实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数时，不同抗凝剂对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。方法采集40例乙型肝炎患者血液，分别置于不含抗凝剂及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-k2抗凝剂的无茵试管中，分离血清和血浆后于-20℃冰箱保存备用。采用实时荧光定量PCR方法检测血清和血浆中乙型肝炎病毒DNA的拷贝数，用配对t检验对检测结果进行统计处理。结果40例乙型肝炎患者不合抗凝荆组的乙型肝炎病毒DNA拷贝数的对数均数为5．66±2．10，含肝素钠组的对数均数为5．42±2．26，含枸缘酸钠组的对数均数为5．36±2．11，含EDTA-k2组的对数均数为5．58±2．16。三种含抗凝剂的标本分别与不合抗凝剂的血清组标本中的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换为对数经配对t检验统计处理，含肝素钠组和枸缘酸钠组的DNA拷贝数与不含抗凝剂组DNA拷贝数差异有统计学意义（P〈0．05），而含EDTA-K2组的DNA拷贝数与不含抗凝荆组的的DNA拷贝数差异无统计学意义（P〉0.05）。结论实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数，应避免使用含肝素钠和枸缘酸钠的血浆标本，使用不合抗凝剂或含EDTA-K2抗凝剂的无菌试管收集标本。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒Ⅰ型（FHV-1）PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1TK基因序列设计合成引物,并以此建立FHV-1的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。用建立的方法对15份猫临床样品进行检测。结果建立的FHV-1PCR检测方法与单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）、犬疱疹病毒（CHV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猫细小病毒（FPV）均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为7lg TCID50/ml,相应的DNA模板浓度为1.46×102拷贝/ml;FHV-1DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用该方法从15份猫临床样本中检测出10份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的感染检测。     

血浆游离DNA的STR分型检测研究

目的：探讨利用血浆中游离DNA进行短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分型检测,解决法医学个体识别和亲权鉴定问题的可行性。方法采集36例无关健康个体EDTA-Na2抗凝血样,分离血浆,采用经典酚-氯仿法分别处理血浆和血细胞,对提取的DNA进行15个STR基因座常规PCR扩增和荧光标记复合扩增,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳检测2种STR分型方法进行检测。结果常规PCR扩增银染检测和荧光标记复合扩增毛细管电泳检测两种STR分型方法的结果表明,同一个体的血浆游离DNA和血细胞DNA STR分型一致,且分型效果接近。结论血浆游离DNA可作为一种有效的生物学样本进行STR分型检测,应用于法医个体识别和亲权鉴定。     

多位点ARMS-PCR法进行HBVS区检测分型

目的：建立一种准确有效的PCR法HBV分型的实验方案。方法对80例包含了 HBV不同型别（B/C/D型）的血清样本进行了 HBV S区测序，通过分析国人 HBV B/C/D型S区碱基固有差异位点，设计得针对各种HBV 型别的高度特异性A RM S引物与探针，并用于另外120例HBV样本的PCR检测实验，同时进行测序进行检测准确度验证。结果多位点ARMS-PCR法与测序法的型别检出吻合率为99．5％，其中一例HBV B/C型混合感染由ARMS-PCR法检出并经追溯确认。结论经验证可见设计于S区型别固有差异位点之上的ARMS引物与探针于PCR检测中能以极高的特异性对 HBV 血清样本进分型，并能检出 HBV 混合型中的劣势病毒株。PCR法以其低成本、结果容易判定以及高灵敏度等优点，于临床HBV分型上是更为推荐的分子诊断学方法。     

运用实时荧光定量PCR技术检测424例患者HPV结果分析

目的探讨采用实时荧光定量PCR反应(qPCR)检测人乳头瘤病毒(HPV)的感染情况及检测HPV分型的临床意义。方法用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测424例门诊患者阴道分泌物中HPV6/11和HPV8个基因型(HPV16、18、31、33、45、52、56、58型)的病毒拷贝数。结果共检出HPV6/11阳性者99例,阳性率为23%,其中<20岁年龄组阳性率最高,达到50%;共检出HPV8个基因型阳性者103例,阳性率为24%,其中>50岁年龄组阳性率最高,达到42%。结论 qPCR检测技术具有灵敏度高、特异性强及操作快捷等特点,可为HPV感染患者的临床治疗及预后观察提供可靠依据,具有较高的临床应用价值。