人源LL-37杀菌多肽的改建及原核细胞中表达

目的改良人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列,提高其杀菌力,并在原核细菌中表达.方法应用蛋白质分析软件(Anthepro 5.0、SWISS-MODEL等),对人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列进行二维、三维结构及理化特性分析,将其中部分氨基酸残基进行替换,提高其正电荷,并以人源杀菌肽LL-37的基因序列为模板,进行相应的DNA序列替换,转入表达载体pET-28a( )于杆菌BL21(DE3)中表达、纯化,并初步研究其抗菌性.结果在维持LL-37空间构象不变的基础上,将Glu16、Asp26、Glu36分别替换为Gln16、Asn26、Gln36,其静电荷由pH 7.4时的 5.8提高到 9.0,并且其多肽N端疏水、C端亲水的特性不变.通过Touch-Down PCR法,成功获得改良LL-37多肽的DNA序列,并将重组质粒pET-28a( )-rLL-37在杆菌BL21(DE3)中表达,改良LL-37多肽成功由强离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化,并对G 、G-菌具有一定的抗菌力.结论将杀菌肽LL-37多肽进行氨基酸残基替换并以原核细胞进行融合型表达是可行的,为改良LL-37的大量制备及杀菌活性研究奠定了基础.     

葡萄糖对水性可降解聚氨酯装载抗菌肽LL-37抑制体外尿源性ESBLs大肠埃希菌生物膜形成的影响

目的：探讨葡萄糖浓度变化对水性可降解聚氨酯（biodegradable waterborne polyurethane,BWPU）装载人源抗菌肽LL-37体外抑制ESBLs大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）生物膜活性的影响。方法：采用尿源性ESBLs E.coli临床株（E44）为实验株,E.coli标准菌株ATCC25922（E0）做质控。构建胱细菌生物膜动态孵育模拟系统。“两步法”制备新型LDI－ＢＷＰＵ乳液PCLPU33。“物理溶解和常温干燥法”制备ＬＤＩ－ＢＷＰＵ装载不同LL-37浓度的载肽膜。设立4个实验分组：H组：高肽组（LL-37,2 000 ?滋g/mL）、L组：低肽组（LL-37,250 ?滋g/mL）、P组：阳性对照（亚胺培南,8 ?滋g/mL）、N组：阴性对照（无抗菌药）,持续感染人工尿液环境下孵育48 h,观察不同葡萄糖浓度（0、11.1、33.3 mmol/L）及控制葡萄糖浓度（33.3→0 mmol/L）对载肽膜抑制生物膜的影响。检测方法包括：生物膜细菌活菌计数;Syto-9/PI荧光染色结合激光共聚焦显微镜构建立体图测量生物膜厚度;扫描电镜观察生物膜结构的细微观。生物膜细菌活菌计数和生物膜厚度的多组间均数比较采用单因素方差分析,α=0.01。结果：基于胱细菌生物膜动态孵育模拟系统,在持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度观测点,P、H、L组生物膜活菌计数和厚度均明显低于N组（aP=0.000）。H组生物膜活菌计数在无糖环境（G0 mmol/L）明显低于L组（bP=0.000）,在含糖环境下（G11.1,33.3 mmol/L）与L组差异无统计学意义（P＞0.01）;H组生物膜厚度在不同葡萄糖观测点均明显低于L组（bP=0.000）。与无糖环境（G0 mmol/L）相比,含糖环境（G11.1,33.3 mmol/L）H、L组生物膜活菌计数和生物膜厚度均明显增加（cP=0.000）。调控葡萄糖浓度后（33.3→0 mmol/L）,H、L组BF细菌活菌计数和生物膜厚度均明显降低（dP=0.000）。结论：持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度时,载肽膜通过抑制生物膜生长、杀灭生物膜细菌明显抑制细菌生物膜形成。     

改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性

目的:将改良LL-37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性. 方法:将编码改良的LL-37多肽的DNA序列放入载体pET-30a( ),转入工程菌BL21 star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL-37. 再以TALON柱芯亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱Macro-Prep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良LL-37的抗菌活性. 结果:改良的LL-37多肽于载体pET-30a( )在杆菌BL21 star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%. 融合蛋白经纯化后用SDS-PAGE鉴定在Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的LL-37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论:改良的人源性LL-37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.     

抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的 研究人抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜的相关作用,为MRSA的预防治疗以及新药物开发应用提供新策略.方法 运用微量肉汤稀释法测定LL-37对临床MRSA菌株的最小抑菌浓度;建立96孔板及6孔板生物膜体外模型;通过结晶紫定量法以及激光共聚焦荧光染色法检测LL-37对MRSA生物膜形成的影响.结果 微量肉汤稀释法测得LL-37对临床MRSA菌株的MIC为12.5 μmol/L.不同浓度LL-37作用后,结晶紫定量法结果表明1/20 MIC亚抑菌浓度的LL-37即可抑制生物膜形成(P＜0.01),且抑制率随用药浓度增加也随之提高,在1/4 MIC条件下生物膜形成抑制率可达到63％.与生理盐水对照组相比,激光共聚焦扫描显微镜下可见,用药组生物膜排列稀疏,厚度变薄,组成菌量明显减少.结论 低浓度的LL-37能够抑制MRSA生物膜的形成,并且对成熟生物膜结构也具有一定的破坏作用.     

抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制

目的：探讨抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长和细胞凋亡的影响,阐明其抗肿瘤作用的可能分子机制。方法：构建LL-37过表达结肠癌HT-29细胞,采用qRT-PCR和Western blotting法检测HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平。30只BALB/c小鼠随机分为对照组（给予未经感染的HT-29细胞）、空载组（给予感染空载质粒的HT-29细胞）、LL-37过表达组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞）、AMPK抑制剂组[给予感染空载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1（Dorsomorphin,Dor）]和联合组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1 Dor）,每组6只。采用结肠癌HT-29细胞复制结肠癌小鼠模型,观察各组小鼠肿瘤体积并绘制生长曲线,感染24 d后剥离肿瘤测量质量并计算抑瘤率,TUNEL染色检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达水平。结果：与对照组和空载组比较,LL-37过表达组小鼠结肠癌HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,肿瘤质量和体积明显降低（P<0.05）,抑瘤率升高（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值均明显升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显降低（P<0.05）;与空载组比较,AMPK抑制剂组小鼠肿瘤质量和体积明显升高（P<0.05）、抑瘤率降低（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.05）;与LL-37过表达组比较,联合组小鼠肿瘤组织中Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05或P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.01）。结论：抗菌肽LL-37能激活AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,进而抑制结肠癌HT-29荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

基于转录组测序分析绿原酸对铜绿假单胞菌的作用机制

目的：分析绿原酸对铜绿假单胞菌PA01转录组的改变，探寻绿原酸对PA01抑菌机制。方法：采用肉汤微量稀释法测定绿原酸对PA01的最低抑菌浓度(MIC);根据MIC测定结果设置绿原酸组(CA组)和对照组，对两组PA01进行转录组测序；随后进行差异表达分析。结果：有370个差异基因表达上调，505个表达下调。GO、COG功能分类显示细胞过程、催化活性、氨基酸转运和代谢等条目中差异基因数量占优势；GO、KEGG富集分析显示，差异基因涉及细菌致病机制、细菌分泌系统、膜整体组件、膜的固有成分、离子跨膜转运蛋白活性、铁载体族非核糖体肽的生物合成和ABC转运蛋白等途径与通路。结论：绿原酸可显著改变PA01的转录谱，Ⅲ型分泌系统、铁载体等有望成为新的抗菌作用靶点。     

LL-37在幽门螺杆菌相关性胃炎中的表达及临床意义

目的检测LL-37在幽门螺杆菌（Hp）相关性胃炎胃黏膜上皮中的表达,评价其在Hp感染的胃黏膜表面的抗菌作用。方法随机选择患者36例,取胃窦黏膜组织,以快速尿素酶及改良Giemsa染色两种方法判断Hp的存在与否。两者同时阳性诊断为Hp阳性,同时阴性为Hp阴性。采用免疫组织化学技术（IHC）检测36例胃炎患者的病变黏膜组织中LL-37蛋白的表达。结果IHC结果显示,LL-37在所有样本中均呈阳性胞质染色。22例幽门螺杆菌阳性胃黏膜均呈中一强阳性染色,幽门螺杆菌阴性胃黏膜组中LL-37为弱阳性染色,差异具有显著性（P〈0．05）。LL-37的表达量与幽门螺杆菌定植数量无明显相关（P〉0．05）。结论LL-37可能因Hp感染诱导呈上调表达,在Hp相关性胃炎中起到一定的抗菌作用。     

异绿原酸对烟曲霉生物被膜的体外作用

目的：探讨金银花活性成分异绿原酸对早期、成熟期烟曲霉生物被膜的体外作用。方法采用微量液基稀释法测定异绿原酸对受试烟曲霉菌株最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）;构建体外早期、成熟期静止生物被膜模型并用不同浓度（64、128、256、512、1024μg/mL）的异绿原酸组分别作用48h,激光共聚焦显微镜（CLSM）检测生物被膜内存活菌;扫描电镜（SEM）观察生物被膜形态学改变;结晶紫染色法定量生物被膜。比较各组MIC和MFC。结果异绿原酸对受试烟曲霉菌株的MIC和MFC均大于1024μg/mL;不论早期或成熟期,空白对照组和异绿原酸各浓度组生物被膜内菌体在CLSM下均以绿色的活菌为主;电镜观察证实异绿原酸可破坏早期、成熟期的生物被膜结构,使胞外基质减少,菌体轮廓清晰;当异绿原酸浓度达到256μg/mL时,可以使载体上不同时期生物被膜的量明显降低,256、512、1024μg/mL异绿原酸组生物被膜定量与空白对照组及组间两两比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论异绿原酸在体外不能杀死烟曲霉生物被膜内菌体,但可对烟曲霉早期和成熟期生物被膜产生破坏作用,其作用呈浓度依赖性。     

人源抗菌肽LL-37衍生物GLL-37抗菌活性研究

目的:对人源抗菌肽LL-37的特定氨基酸残基进行替换,获得衍生抗菌肽GLL-37,以增强其抗蛋白酶解能力和抗菌活性。方法:肽LL-37和GLL-37均由化学合成。采用微量稀释法测定它们对6种革兰氏阴性和阳性菌的最低抑菌浓度,以及在不同NaCl浓度下,它们对大肠埃希菌ATCC 25922的最低抑菌浓度。将LL-37和GLL-37与弹性蛋白酶共孵育后,通过对共孵育产物进行蛋白聚丙烯凝胶电泳和抗菌活性测定,研究它们抗弹性蛋白酶水解的能力。结果:GLL-37较LL-37对弹性蛋白酶的水解作用更具抵抗力。在高浓度NaCl下,GLL-37也较LL-37具有更强的抗菌活性。结论:通过对LL-37氨基酸序列中特定氨基酸残基的替换,可增强其抗菌活性及抗弹性蛋白酶水解能力,获得的衍生肽GLL-37具有很高的研究开发价值。     

外源性单磷酸鸟苷环二聚体防龋的动物实验研究

初步探讨外源性单磷酸鸟苷环二聚体（c-di-GMP）对大鼠口腔内龋齿的防龋效果。方法 SPF大鼠感染致龋菌后,随机分成3组,分别用外源性c-di-GMP、氟化钠水溶液、质量体积比为0.9%氯化钠给大鼠施药,用唾液取样细菌培养、龋齿记分观察外源性c-di-GMP在动物口内对致龋菌的生长繁殖以及对龋病发生、发展的影响。结果 通过唾液取样进行变形链球菌培养计数,c-di-GMP组与阴性对照组相比,无显著性差别（P>0.05）;Keyes 龋齿记分结果显示,c-di-GMP组龋损程度及数量都均少于对照组（P<0.05）,从龋病发展程度看,c-di-GMP组最为缓慢,仅存在釉质和牙本质浅层龋损。结论 外源性c-di-GMP可以有效抑制大鼠龋齿的发生和发展,有望成为一种新型防龋药物。     

抗菌肽LL-37重组载体的构建

目的从健康人的外周静脉血中获得人类基因组DNA,扩增出抗菌肽LL-37的全长基因,插入原核表达载体pQE-30以获得重组表达载体pQE-30／LL-37。方法用NaI法从健康人外周静脉血中提取人类基因组DNA,然后以它为模板PCR扩增得到LL-37全长基因,酶切回收后连接。结果得到了较高品质的人类基因组DNA,扩增得到了LL-37全长基因,成功构建了重组表达载体pQE-30／／LL-37。结论用生物方法生产抗菌肽是一种很有希望的产业,而抗菌肽LL-37的重组载体的构建成功为以后进一步的实验打下了基础。     

抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用

目的研究抗菌肽LL-37 对鲍曼不动杆菌生物膜的影响,为将来在临床感染的控制和新抗菌药物的研发提供科学的依
据。方法运用平板结合结晶紫染色法体外建立鲍曼不动杆菌生物膜模型,肉汤稀释法检测LL-37的最小抑菌浓度;采用扫描
电镜和结晶紫染色定量法观察抗菌肽LL-37作用后生物膜结构和量的改变。结果成功体外建立鲍曼不动杆菌生物膜模型,测
得抗菌肽LL-37 MIC为64 μg/ml;经过抗菌肽LL-37作用后,鲍曼不动杆菌成熟生物膜结构被破坏。当LL-37浓度为2.5 μg/ml
时即可破坏生物膜结构,且随着LL-37浓度增加,生物膜的量逐渐减少。结论抗菌肽LL-37在浓度远小于其MIC时即可破坏
鲍曼不动杆菌生物膜结构。
     

巨噬细胞通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18调控卵巢癌细胞的增殖

目的 研究巨噬细胞是否通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18对卵巢癌细胞的生长增殖进行调控。方法 采用Millicell插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和卵巢癌细胞株SKOV3;通过细胞计数法检测巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测共培养上清中的相关细胞因子及LL-37的水平;实时定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平检测巨噬细胞和SKOV3细胞中LL-37 mRNA的表达水平;应用LL-37中和抗体抑制LL-37的功能及活性,进而通过MMT细胞增殖实验探讨LL-37对巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖的调控。结果 细胞计数法检测结果显示,巨噬细胞与卵巢癌细胞SKOV3共培养后,可促进其增殖;共培养的上清中,LL-37及IL-6水平明显升高;实时定量RT-PCR在mRNA水平共培养中的巨噬细胞其LL-37基因表达升高,且其表达水平随时间的延长而增加;应用LL-37的中和抗体,可明显抑制巨噬细胞对SKOV3细胞的增殖促进作用。结论 在与卵巢癌细胞共培养的环境中,巨噬细胞通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌水平促进卵巢癌细胞的增殖,LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌的发展中扮演重要角色。     

反复上呼吸道感染患儿补充维生素D后LL-37、IL-10含量变化

目的 研究反复上呼吸道感染与LL-37、IL-10及维生素D的相关性。方法 将64例反复呼吸道感染患儿随机分成2组,实验组给予常规治疗同时补充维生素D,对照组给予常规治疗同时给予安慰剂。随访12个月,检测治疗前基线含量和治疗12个月后血浆25-羟维生素D₃、IL-10及痰上清LL-37的变化。结果 实验组与对照组比较,LL-37、IL-10及25-羟维生素D₃含量均显著增高(P<0.05),呼吸道感染次数显著下降(P<0.05)。实验组治疗12个月后25-羟维生素D₃、LL-37、IL-10均显著增高(P<0.05),呼吸道感染次数显著下降(P<0.05)。实验组治疗12个月后LL-37含量、IL-10含量、25-羟维生素D₃含量均呈正相关(P<0.05)。讨论 补充维生素D有助于减少反复上呼吸道感染次数,这种作用可能与LL-37及IL-10产生增加有关。     

白藜芦醇通过上调脂肪变性HepG2细胞Sirt3表达改善线粒体功能

目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RSV)对脂肪变性肝细胞线粒体功能的影响,以及沉默信息调节因子3(sirtuin 3,Sirt3)在其中的重要作用.方法 用0.2 mmol/L棕榈酸(palmitic acid,PA)处理HepG2细胞24 h建立肝细胞脂肪变性模型,再用40 μmol/L RSV和/或50 μmol/L Sirt3抑制剂3-TYP处理24 h.实验分为对照组、PA组、PA+ RSV组、PA+ RSV+ 3-TYP组、PA+ 3-TYP组.用相关试剂盒检测甘油三酯(TG)含量、沉默调节蛋白3(sirtuin 3,Sirt3)活性、ATP合酶活性、ATP生成量以及线粒体基础呼吸率,使用DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,Westernblot检测Sirt3蛋白表达.Sirt3 siRNA处理HepG2细胞后再用PA和/或RSV处理,分析ROS和甘油三酯含量.结果 相对于PA组,PA+RSV组HepG2细胞的甘油三酯、ROS含量明显降低(P＜0.05),ATP合酶活性、ATP生成量和基础呼吸率明显提高(P＜0.05).而3-TYP或Sirt3 siRNA处理后,RSV的上述作用被削弱(P＜0.05).结论 RSV通过上调脂肪变性肝细胞Sirt3的表达与活性而改善其线粒体功能.     

失笑散对实验性心肌缺血大鼠血液流变学的影响

目的:观察失笑散颗粒对心肌缺血大鼠血液流变学的影响。方法:60只雄性SD大鼠随机平均分成空白对照组,模型组,失笑散颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组,阳性药物对照组。空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水,其余各组分别给予相应药物,均采用灌胃方式,连续7 d,从第3日起,除正常对照组外,其余各组均于给药后1 h皮下注射异丙肾上腺素5 mg·(kg·d)~(-1),连续5 d,时间间隔为24 h;正常对照组给予等量生理盐水皮下注射,记录给药前及第5次注射异丙肾上腺素后心电图。末次注射后2 h,处死动物,取血制备血清,用全自动生化检测仪测定心肌酶;处死后立即取出心脏,制备心肌匀浆,试剂盒法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)。结果:模型组与空白对照组相比,实验大鼠心肌缺血阳性率明显升高,全血黏度、血浆黏度、红细胞压积均升高,血沉降低,天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、磷酸肌酸激酶(creatine phosphate kinase,CPK)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、肌钙蛋白T(troponin T,Tn T)、MDA均升高(P0.05),SOD降低(P0.05);失笑散颗粒高剂量组与模型组相比,心肌缺血阳性率明显降低,全血黏度、血浆黏度、红细胞压积均降低,血沉升高,AST、LDH、CPK、BNP、Tn T、MDA均降低(P0.05),SOD升高(P0.05);阳性药物对照组与模型组相比,心肌缺血阳性率降低,全血黏度、血浆黏度、红细胞压积均升高(P0.05),LDH、CPK均降低(P0.05)。结论:失笑散颗粒能够缓解实验性大鼠心肌缺血症状,且高剂量的失笑散颗粒对心肌缺血的疗效更显著,为失笑散颗粒型的临床应用提供了制剂学基础和药效学依据。     

真核表达hCAP-18/LL-37成熟肽对树突状细胞表面分子表达的影响

目的：研究真核表达的人源阳离子抗菌肽-18(hCAP-18)成熟肽LL-37对树突状细胞(DCs)表面分子表达的影响。方法：通过基因克隆方法构建hCAP-18成熟肽LL-37真核表达载体pcDNA4/Myc-His-LL-37,转染人胚肾HEK293细胞株,转染48 h后收获培养上清,与体外以rh-GM-CSF、rh-IL-4联合培养定向诱导分化的不成熟DCs共培养48 h,收获DCs;流式细胞仪检测DCs表面分子CD40及HLA-DR的表达。结果：成功构建成熟肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-LL-37,并实现在其真核细胞HEK293中的表达;流式细胞仪结果显示,pDNA4/Myc-His-LL-37基因转染HEK293细胞培养上清刺激组DCs中CD40及HLA-DR的表达阳性率与对照组比较均明显升高(P<0.05)。结论：构建了真核表达的hCAP-18成熟肽LL-37,其可上调DCs表面分子CD40及HLA-DR的表达,促进DCs功能的成熟。