肝细胞核因子3β调控小鼠体内HBV转录和复制的实验研究

目的 应用复制型HBV小鼠模型观察肝细胞核因子3β(HNF3β)对小鼠体内HBV转录和复制的调控作用.方法 通过尾静脉高压注射法将复制型HBV重组质粒pHBV4.1和大鼠HNF3β表达质粒pCMVHNF3β导入小鼠体内,用Northern吸印杂交检测小鼠肝组织中HBV 3.5kb、2.4/2.1kb、0.7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平.结果 经小鼠尾静脉高压注射法体内转染质粒pHBV4.1后,小鼠肝组织中检测到HBV 3.5kb、2.4/2.1kbmRNA转录信号和HBV DNA复制中间体信号;与共转染pHBV4.1和空载质粒pCMVpA对照组相比,共转染pHBV4.1和pCMVHNF3β使HNF3β过量表达,明显降低了小鼠体内HBV RNA转录和DNA复制水平.结论 肝富集转录因子HNF3β对小鼠体内HBV转录和复制具有抑制作用,有可能成为今后抗HBV生物治疗新的靶点.     

TIA-1通过影响肝细胞转录因子的活性调节HBV的e抗原和s抗原表达

目的证明TIA-1分子具有调节HBV基因表达的功能。方法TIA-1真核表达质粒pcDNA3-TIA-1，用脂质体转染HepG 2．2．15细胞后，ELISA检测e和s抗原的表达；RT-PCR检测与HBV复制有关的转录因子HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、RXRα、PPARα、C／EBP的表达。结果与正常的HepG 2．2．15细胞相比，转染pcDNA3-TIA-1质粒的HepG 2．2．15细胞，其e抗原的表达量明显的增高，而s抗原表达量明显的降低。与正常的HepG 2．2．15细胞相比，转染pcDNA3-TIA-1质粒的HepG 2．2．15细胞中的HNF1、HNF2、RXRα mRNA含量有明显的下降。结论TIA-1蛋白能通过影响与HBV复制有关的转录因子活性，调节HBVe抗原和s抗原的表达。     

过氧化物酶体增殖物激活受体在乙型肝炎病毒的转录与复制中的作用研究现状

<正>乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒,通过逆转录机制复制。HBV基因组转录生成3. 5kb HBV m RNA（前基因组RNA）是病毒复制过程中最关键的步骤[1]。多种细胞转录因子通过激活HBV核心启动子,促进病毒前基因组RNA的转录生成和病毒的逆转录复制[2-3]。在这些细胞转录因子中,肝富集转录因子最受关注,是调节前基因组RNA转录的<正>乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒,通过逆转录机制复制。HBV基因组转录生成3. 5kb HBV m RNA（前基因组RNA）是病毒复制过程中最关键的步骤[1]。多种细胞转录因子通过激活HBV核心启动子,促进病毒前基因组RNA的转录生成和病毒的逆转录复制[2-3]。在这些细胞转录因子中,肝富集转录因子最受关注,是调节前基因组RNA转录的     

金丝桃素抗乙型肝炎病毒作用及机制的体外研究

目的：从细胞水平评价金丝桃素（HY）的抗乙型肝炎作用,并初步探寻其药物作用靶点。方法选择可分泌乙型肝炎病毒的肝细胞株 HepG2．2．15为实验对象,HY 为 HY 组,拉米夫定（3TC）为3TC 组,去离子水为空白对照组,对细胞进行分组给药。给药72 h 后,采用 Southern 印记杂交及荧光定量 PCR 检测病毒 HBV-DNA 的复制水平;ELISA 检测 HBV 表面抗原（HBsAg）和 HBVe 抗原（HBeAg）的抑制率;采用 Northern blot 与荧光定量 PCR 检测 pgRNA 的表达水平;Western blot 及荧光定量 PCR 检测调控因子肝细胞核因子3（HNF3β）、肝细胞核因子4（HNF4α）、过氧化物酶体增殖激活受体／视黄受 X 受体（PPARα／RXRα）的表达水平。结果与空白对照组相比,HY 组与3TC 组对 HepG2．2．15细胞中的 HBV DNA 及 HBsAg、HBeAg 的表达有明显抑制作用（P ＜0．05）。与空白对照组相比,HY 可显著减少 pgRNA 的表达（P ＜0．05）,而3TC 无明显变化（P ＞0．05）。与空白对照组和3TC 组相比,HY 对调控因子 HNF3β与 HNF4α的表达有显著影响（P ＜0．05）,但对 PPARα和PXRα的表达无影响（P ＞0．05）。结论 HY 具有强效抗乙型肝炎病毒作用,且其可使负向调控因子 HNF3β的表达升高并降低正向调控因子 HNF4α的表达。提示其药物作用靶点可能为 pgRNA。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达

目的 观察体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达和分布.方法 从大鼠骨髓中分离间充质干细胞,体外诱导分化为肝细胞.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 比较肝细胞分化过程中转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)、CCAAT增强子结合蛋白α和β(C/EBPα和C/EBPβ)在诱导分化组和对照组中的表达水平;免疫荧光染色方法 检测HNF4α在细胞中的表达定位.结果 在肝细胞分化成熟过程中,转录因子HNF4α和C/EBPα的mRNA表达水平在诱导分化早期的细胞中显著高于对照组细胞,而C/EBPβ mRNA表达水平在分化成熟的细胞中显著高于对照组细胞(P<0.05).免疫荧光染色结果 显示,HNF4α定位于分化细胞核内.结论 在肝细胞分化过程中,转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ呈特征性时序表达,表明骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时,肝细胞相关转录因子的表达与细胞分化的启动和维持密切相关.     

PGC-1α辅助激活人PEPCK基因转录

 【目的】构建人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子荧光素酶报告质粒PGL3-hPCK-luc,并探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)在转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)介导下对人PEPCK基因启动子活性的影响。【方法】从人全血基因组DNA中克隆PEPCK启动子基因片段,并重组进荧光素酶报告载体PGL3-basic,将pcDNA3.1-PGC-1α、pcDNA3.0-HNF4α表达质粒与PGL3-hPCK-luc按不同组合共转染进人肝癌细胞株HepG2细胞或正常人肝细胞株LO2细胞,培养48 h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性。【结果】通过酶切鉴定及测序证明扩增的人PEPCK启动子片段成功插入载体质粒中。转染后人PEPCK启动子基因荧光素酶活性较空白对照组增加60倍(P < 0.05);共转染质粒进HepG2细胞或LO2细胞后,HNF4α均可以增强人PEPCK启动子基因荧光素酶活性,在HepG2细胞,荧光素酶活性是对照组的2.69倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是对照组的3.64倍(P < 0.05);PGC-1α可以明显增强HNF4α对人PEPCK启动子的激活作用,在HepG2细胞,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.01倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.82倍(P < 0.05)。而与单一转染组相比,共转染pcDNA3.1-PGC-1α与pcDNA3.0-HNF4α显著增加了PEPCK的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05)。【结论】人PEPCK启动子基因报告质粒成功构建,且转录因子HNF4α可以激活人PEPCK启动子活性,辅助激活因子PGC-1α可以进一步加强HNF4α的作用。     

mfgl2凝血酶原酶/纤维介素基因转录调控元件肝细胞核因子的研究

目的 研究鉴定mfgl2凝血酶原目影纤维介素基因转录激活所必需的调控元件或转录因子。方法应用免疫印迹法检测Balb／c小鼠的巨噬细胞内是否表达肝细胞核因子4(HNF4),共聚焦显微镜免疫荧光技术检测鼠肝炎病毒(MHV)的核心(N)蛋白质是否进入被感染细胞核。应用：DNA电泳迁移差异检测、竞争实验和定点诱变技术鉴定—mfgl2基因转录激活所必需的调控元件或转录因子。结果 免疫印迹法表明巨噬细胞可持续表达HNF4。共聚焦显微镜免疫荧光技术证实MHV的N蛋白质可进入被感染细胞核内。凝胶移位分析和竞争实验显示HNF4和巨细胞病毒早期蛋白基因1．2(IEl.2)均可与特异寡核苷酸竞争结合mfgl2启动子上特定位点而不与非特异寡核苷酸发生竞争。HNF4特异性多克隆抗体竞争试验可见超迁移带。定点突变mfgl2启动子上：HNF4所结合的顺式调控元件可降低野生型mfgl2启动子的转录活动达75％,联合突变IE1-2结合位点未见协同效应。单纯突变IEl．2结合位点后,野生型nl龟12启动子的转录活动仍可保留75％-80％。结论 HNF4具有与mfgl2／fibroleukin启动子结合的特性,为MHV-3N蛋白质诱导mfgl2／fibroleukin基因表达的必备转录因子。     

肝细胞核因子4α在肝脏疾病中的研究进展

肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)是核激素受体超家族的一种转录因子,在调控肝细胞分化和维持肝脏生物学功能中起重要作用。近年研究发现,上调HNF4α的表达可阻断肝纤维化等肝脏慢性疾病进程,同时,HNF4α与乙肝病毒的转录和复制有关,本文就HNF4α在肝脏疾病中的作用机制的作一综述。     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

乙型肝炎病毒对SOX4表达的影响及其机制探讨

目的 观察乙型肝炎病毒(HBV)对SOX4表达的影响,并探讨其机制.方法 RT-PCR和Western印迹法检测HepG2和HepG2.2.15细胞中SOX4 mRNA和蛋白表达的差异,将HBV感染性克隆pHBV1.3及其空载体分别与含SOX4基因启动子的报告质粒pGL3-SOX4共转染HepG2细胞,测定荧光色素酶的活性,RT-PCR和Western印迹法分别检测SOX4 mRNA和蛋白表达的情况.结果 HepG2.2.15细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达水平明显高于HepG2,HBV能够激活SOX4基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调SOX4的表达.结论 HBV能够在转录和翻译水平上调SOX4的表达.     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

载体介导的RNAi抑制乙肝病毒S基因的研究

目的构建针对乙肝病毒S基因的RNAi表达载体,观察其对HBV表达的影响。方法合成针对HBVS基因的RNAi寡核苷酸,克隆入pSUPER载体,与pHBV质粒共转染HepG2细胞。ELISA和Westernblot检测HBsAg表达。结果成功构建针对HBVS基因的RNAi表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2对HBsAg的抑制率分别为79.0%和43.2%,无关序列的RNAi表达载体无此作用。结论载体介导的RNAi能高效、特异地抑制HBVS基因的表达。     

肝细胞核因子3对Ⅱ型葡萄糖载体启动子活性及蛋白表达的影响

[目的]探讨在CV-1细胞中肝细胞核因子3（HNF3）对Ⅱ型葡萄糖载体（GLUT2）表达的影响．[方法]利用DNA克隆技术将HNF3cDNA序列重组到表达载体pSV—sport上,GLUT2cDNA克隆到载体pGL3b上．通过CV-1细胞株的体外培养将HNF3转染CV-1培养细胞,应用荧光素酶活性测定和Westernblot方法观察HNF3对GLUT2的启动子活性及蛋白质表达的影响．[结果]HNF3可增高GLUT2的荧光素酶活性及蛋白质表达水平．[结论]HNF3可能通过调节GLUT2的表达参与胰岛素对血糖的调节过程．     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

Extract from Phyllanthus urinaria L. Inhibits Hepatitis B Virus Replication and Expression in Hepatitis B Virus Transfection Model in Vitro

Objective: To explore the effects of the extract from Phyllanthus urinaria L. on hepatitis B virus (HBV) replication and expression in HBV transient transfection model in vitro. Methods: The eukaryotic expression plasmid pHBV1.1, which contains 1.1-fold-overlength genome of HBV, was transfected into the human hepatoma cell line, HepG2, to establish and assess the HBV transient transfection model. The extract from Phyllanthus urinaria L. was prepared in different concentrations and methyl thiazolyl tetrazolium was used to detect the maximum nontoxic concentration of the drug. The extract from Phyllanthus urinaria L. were added into the transfected cell, at the concentrations of 0.8, 0.2 and 0.05 g/L, respectively. Four days after drug application, enzyme-linked immuno sorbent assay was used to detect the concentration of HBsAg in the supernatants, Southern blot was applied to analyze HBV DNA level, and Western blot was used to detect the expression of HBcAg in cells. Results: After the transfection of plasmid pHBV1.1 into HepG2 cells, the concentration of HBsAg in supernatants was increased obviously as compared with that of the normal cells (P<0.05), and all expected HBV replicative intermediates were confirmed by Southern blot analysis, which ensured the successful establishment of the HBV transient transfection model. After the application of drugs at the concentrations of 0.8 and 0.2 g/L, the level of HBsAg was obviously decreased in the supernatants, as compared with that of the virus group (P<0.05); Southern blot showed that the level of HBV rc DNA, ds DNA, ss DNA was obviously reduced compared with that of the virus group (P<0.01); Western blot revealed that the expression of HBcAg in the drug group was obviously inhibited, as compared with that of the virus group (P<0.01). Conclusions: The extract from Phyllanthus urinaria L. obviously inhibited replication and expression of HBV in HBV transfected cell lines in vitro, thus exerting distinctive anti-HBV effects.