结直肠恶性肿瘤类器官和类组装体的药物筛选新进展及临床应用展望

类器官(organoid)、类组装体(assembloids)作为具有三维结构的微器官, 可高度模拟来源组织的形态结构与生理功能, 培养出有稳定表型的组织结构, 是用于临床疾病研究的良好模型。类器官、类组装体相关研究进展迅速, 应用前景广阔, 在生理学、器官移植、生物信号传导、药物研发、高通量筛选及肿瘤个体化治疗等研究中具有重要意义。本文针对类器官、类组装体在结直肠恶性肿瘤中的研究进展进行简要综述, 探讨了类器官、类组装体模型的产生、发展进程, 概括了现有的类器官、类组装体培养技术及其应用场景, 特别是在结直肠恶性肿瘤研究和药物筛选等方面的进展。这些研究成果表明类器官、类组装体作为结直肠恶性肿瘤研究中一种新颖可靠的临床模型, 在高通量药物筛选中优点突出, 可结合联合液体活检、基因编辑、肿瘤免疫治疗等技术在多个研究领域发挥效用。     

血管化类器官的构建思路与技术挑战

类器官因其可在体外最大化模拟人体组织器官的结构和功能,成为近年来新药研发、病理毒理研究和机理探索的优选模型载体。随着再生医学技术的发展和类器官相关研究的逐步深入,缺乏血管化微环境的类器官在培养后期受限于氧气、营养物质的缺失,出现细胞凋亡甚至组织坏死,难以长期维持结构和功能,成为类器官进一步推广应用的关键桎梏。本文围绕上述问题,从血管的形成以及目前血管化类器官的体外构建体系进行综述,凝练血管化类器官培养中存在的核心问题,以期为血管化类器官的研究与应用提供新视角。     

类器官的研究现状及其作为临床前模型的应用

体外培养的类器官主要由成体干细胞和多能干细胞分化而来.现已培养出肠道、泌尿生殖系统、脑、肝脏等多种类型的类器官.作为一种新兴的模拟人体器官发育及疾病发生发展过程的研究模型,已在疾病建模、筛选抗癌药物、药物开发、基因及细胞疗法中得到广泛的应用.该文主要针对培养体系成熟类器官的研究现状及类器官作为疾病的临床前模型的应用作一...     

类器官在人类病毒研究中的应用进展

病毒是危害人类健康的重要病原体，由于缺乏能再现病毒自然感染过程的体外研究模型，这为深入研究病毒致病机制、宿主-病毒之间相互作用等带来了巨大挑战，严重阻碍了病毒致病机制的研究、抗病毒药物的筛选和疫苗的开发。类器官技术能在体外构建模拟体内组织结构和生理功能的实验模型，被认为是目前最具潜力的病毒感染研究模型。文章就类器官在病毒体外培养、宿主-病毒相互作用、病毒致病机制及抗病毒药物筛选等研究中的应用进展作一综述。     

采用人肿瘤类器官研究阻断Wnt信号治疗大肠癌的可行性

目的建立和优化大肠癌患者肿瘤类器官培养体系,为研究阻断Wnt信号治疗大肠癌提供新模型。方法选择大肠癌患者18例,收集癌组织及癌旁组织配对标本。采用定量PCR测定癌组织和癌旁组织Wnt3 m RNA和肠干细胞标记分子Lgr5、Ascl2的表达水平。术中采集肿瘤组织,使用类器官培养基培养肿瘤类器官。使用Wnt信号抑制剂IWP-2处理肿瘤类器官,观察IWP-2对肿瘤类器官形态、生长等的影响。结果定量PCR表明,与癌旁组织相比,肿瘤组织中的Wnt3表达水平较高[分别为(1.00±0.08)和(2.99±0.27),P0.01]。癌旁组织和肿瘤组织Lgr5[分别为(1.00±0.05)和(5.63±1.80),P0.01)]、Ascl2[分别为(1.00±0.39)和(4.03±0.33),P0.05]的表达水平也较高。IWP-2处理可显著抑制肿瘤类器官生长[未处理和处理后类器官面积分别为(10.02±1.34)×10~4m~2和(2.97±0.62)×10~4m~2,P0.01]。结论Wnt信号通路激活和大肠癌发生密切相关,抑制Wnt信号可有效抑制肿瘤细胞生长,可能是治疗大肠癌的一种有效方法。肿瘤类器官可以作为筛选大肠癌治疗药物的一种模型。     

人肺鳞癌类器官三维培养体系的建立

目的：探索构建人肺鳞癌体外类器官培养的实验方法,并对成功建立的类器官模型进行组织层面评估。方法：收集早期肺鳞癌患者手术切除的新鲜原位肿瘤标本,在以基质胶凝固液滴为基础的培养基中进行体外类器官培养,倒置显微镜观察类器官生长情况;将培养的类器官用Histogel包埋并制成石蜡标本,切片进行HE染色及免疫组化染色。结果：成功建立了肺鳞癌类器官的体外培养方法,HE染色提示细胞核浆比高,核异型性符合肺鳞癌细胞特征;免疫组化显示细胞P63阳性,TTF-1阴性,与肺鳞癌分子病理特征相符。结论：本实验初步建立了人肺鳞癌患者的体外类器官培养平台,将为肺鳞癌的基础研究和靶向药物的筛选提供新模型。     

人脑类器官在神经发育疾病研究中的应用

人脑类器官是由人多能干细胞(hPSC)包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多功能干细胞(hiPSC)衍生而来的三维组织,能模拟人大脑的结构和功能,作为神经发育疾病的体外研究模型独具优势。本文将对神经疾病体外模型建立和发展的历程、脑类器官在神经发育疾病研究中的应用、相关前沿技术和脑类器官技术的结合等进行综述和展望。     

分化可控的人类鼻粘膜类器官模型的建立

目的 建立分化程度可控、能够重现来源组织结构和功能的人类鼻粘膜类器官模型。方法 采集手术切除的新鲜中鼻甲和鼻息肉组织,将消化过滤的鼻粘膜上皮细胞分为连续“扩增”培养组（EO组）及“扩增-分化”分段培养组（DO组）。分别在基于气液界面进行体外3D类器官培养,通过STR鉴定、电镜及免疫组化染色分别对两组鼻粘膜类器官的结构、细胞组成及纤毛功能进行鉴定。再通过PAS染色对DO组中分化后的鼻粘膜类器官分泌功能进行鉴定。结果 整个培养期间,均能生长出直径逐渐增大的空泡状或实心球状3D类器官。培养第16天,DO组多为空泡状类器官,EO组多为实心球状类器官,DO组空泡数比例大于EO组（[ 21.67±8.57）% vs（54.67±13.26）%,P<0.05]。将鼻粘膜类器官与来源组织同时进行STR检测,匹配度为100%。培养第21天,DO组鼻粘膜类器官扫描及透射电镜显示纤毛超微结构,而EO组多显示出短绒毛结构。免疫组化染色结果显示,呼吸区粘膜主要包含P63（基底细胞）、β-tubulin（纤毛柱状细胞）、MUC5AC（杯状细胞）。相比EO组,DO组类器官纤毛细胞数[(7.95± 1.81)% vs (27.04±5.91)%,P<0.05]及杯状细胞数[(14.46±0.93)% vs (39.85±5.43)%,P<0.05）占比更大,基底细胞占比差异无统计学意义（P>0.05）。DO组中分化后的鼻粘膜类器官糖原染色呈阳性表达。结论 本研究首次采用“扩增-分化”分段式培养法,培养出能够在体外长期稳定生长、高度拟似来源组织形态结构和功能（纤毛功能及分泌功能）,且分化程度可控的鼻粘膜类器官。     

肺类器官——研究人类肺部发育和疾病的新途径

肺系统由气道和肺泡腔两部分组成,其组织和细胞的复杂性保证了肺部的免疫防御和气体交换功能.虽然传统体外细胞实验和动物模型已被广泛用于阐明人体肺发育、生理学和发病机制,但这些模型不能准确地再现人体肺部环境和细胞之间的相互作用.研究发现肺类器官是目前最接近人类肺系统的模型,而以肺类器官为代表的体外肺模型也成为研究肺发育、功能和疾病病理学的一种更容易获得的工具.本文主要介绍肺类器官的主要类别及研究现状、肺类器官的培养过程、肺类器官技术的独特应用、肺类器官培养的主要局限.     

三维条件下类器官培养的研究进展

类器官是成熟器官来源的三维上皮结构,包含干细胞或祖细胞,能够独立扩增并且分化为器官特异性上皮.利用三维方法培养类器官技术在组织再生、研究机体生理病理学、构建疾病模型及药物筛选等方面均有广阔的前景应用.本文将就三维条件下类器官培养的基础、应用和前景作一简要综述.     

心脏类器官的研究进展及其临床应用

心血管疾病是对人类健康的严重威胁，也是全球死亡的主要原因。传统的二维（two dimensional，2D）细胞模型及动物模型具有各自的局限性，不能完全适用于心血管疾病的发病机制及治疗研究。类器官是一种在体外三维（threedimensional，3D）培养并模拟体内器官的细胞结构，可以更准确地保留体内细胞的生物学特性和功能，为心血管疾病的研究开辟了新的方向与思路。目前众多研究报道了心脏类器官的构建方法及其在药物实验、疾病模型、再生医学与治疗等方面的应用。文章概述了心脏类器官的构建方法及其在临床上的应用，同时也提出了其发展前景和局限性。     

携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官的建立和培养

目的 探索肝细胞癌类器官的建立和培养,进行靶向测序和药物筛选,为患者个体化治疗提供参考。方法 将肝细胞癌患者肿瘤组织消化为单细胞后种于基质胶Matrigel中培养。HE染色观察类器官与原代肿瘤组织细胞形态,采用免疫组化验证类器官与原代肿瘤组织中细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白8(CK8)、p53、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)等分子表达情况,靶向测序检测类器官中肿瘤相关基因突变情况,根据靶向测序结果进行药物筛选,检测varlitinib、sorafenib、顺铂和nutlin3四种化合物对类器官活性的影响。结果 成功建立了携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官,HE染色结果显示,类器官与原代肿瘤组织具有极为相似的结构和细胞特征。免疫组化结果显示类器官与原代肿瘤组织的CK7均为阴性,CK8、p53和GPC-3均为阳性。靶向测序结果显示类器官中突变基因有TP53(E271K, 100%), ERBB2(A1232V, 62.29%), RUNX1(E395A, 20.21%), AR(Q91dup, 70%)。细胞活力检测(CellTiter-Glo)结果显示,ERBB1/2特异性的抑制剂varlitinib和激酶多靶点抑制剂sorafenib对类器官的IC50分别为2.81μM和1.327μM,顺铂组的IC50为40.98μM,nutlin3对类器官生长无明显影响。结论 我们成功建立了一例携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官,该类器官保留了原代肿瘤组织的结构和分子特征,药物筛选结果可能为该患者的个体化治疗提供参考。     

心脏类器官的生物构建策略及应用进展

类器官是一种在体外利用人诱导多能干细胞构建的三维生物组织工程,能够高度的模拟体内细胞的生物学特性和功能。在全球范围内,心血管疾病是导致死亡的主要原因,相关研究主要局限于传统的二维细胞和动物模型。人类心脏类器官是复杂的多细胞聚集物,包括心脏组织的转录、功能和形态特征,在疾病机制研究、药物实验、再生医学等领域的发挥重要作用。本文主要介绍心脏类器官模型的生成方法,类器官在心血管疾病中应用进展,及心脏类器官的前景和面对的挑战。     

类器官技术在肺部疾病研究中的应用

类器官主要是指成体干细胞、人类多能干细胞或胚胎干细胞通过三维培养建立的一种能够高度模拟原组织或器官的结构和功能的体外模型,与人体组织具有高度同源性及遗传一致性,目前在人体各个系统的研究中均有广泛应用。本文就类器官技术在肺部疾病研究中的应用作一综述,以期为肺部疾病的研究发展提供参考方向。     

类器官培养的研究进展

类器官是将具有干性潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的部分组织。类器官能准确模拟体内上皮结构并能长期传代培养。这些模型的目的是为了从分子水平到细胞、组织、器官或整个有机体来阐述身体的功能。目前已成功建立了人与鼠胃、小肠、肝脏、胰腺、前列腺等类器官模型［1－4］。这些类器官模型均能进行长期培养，且具有稳定的表型和遗传学特征。类器官的培养为我们建立了更可靠的疾病模型，而且类器官也可作为筛选药物的新途径。类器官的培养不仅开发了一种检测细胞介导的和药物引起的疾病模型新方法，同时也开辟了基因和干细胞治疗疾病的新途径。     

小肠类器官的构建及传代培养

目的探索小肠隐窝分离,小肠类器官培养、传代、冻存、复苏和蛋白提取的方法,研究R-Spondin1的浓度对小肠类器官成熟的影响。方法分离小鼠小肠隐窝,在模拟体内肠道干细胞生长、增殖的体外3D培养体系中培养,倒置显微镜观察小肠类器官的形成过程。用1 mL注射器切割小肠类器官进行传代。设置R-Spondin1浓度梯度,在不同时间点比较小肠类器官形态。结果成功的完成了小肠类器官的分离培养、传代、冻存、复苏及蛋白提取工作。确定了隐窝与单细胞可以进行培养的比例标准且发现在R-Spondin1浓度低于0.5μg/mL的培养基中,小肠隐窝不能成长为成熟的小肠类器官。结论小肠类器官体外培养体系的建立,尤其传代培养的成功将为在体外长期研究小肠上皮提供新的、更符合生理的实验模型。隐窝与单细胞比例标准的确定将大幅提高小肠类器官培养的成功率,蛋白质的提取将有利于蛋白组学的研究。     

人胆囊类器官培养体系的建立与鉴定

目的 构建人胆囊上皮细胞类器官的培养体系,实现人胆囊类器官体外稳定快速扩增,并鉴定其具有的特性。 方法 分离人来源胆囊组织上皮细胞,运用三维培养体系,将细胞嵌入基质胶中进行3D培养。观察胆囊类器官生长过程中球囊样结构的面积、周长与形态。利用免疫细胞荧光染色技术检测胆囊类器官的干性指标和胆管上皮细胞标志物表达情况。使用BrdU摄入实验,检测小分子CHIR-99021和Blebbistatin对类器官的增殖特性的影响。 结果 胆囊类器官在体外培养过程中,类器官形成的球囊面积逐渐增大,第1天为（1.15±0.12）×10^4μm2,第7天为（18.97±1.64）×10^4μm2,（P<0.01）,第7天时其形状因子增高至（0.83±0.003）,表明类器官在体外稳定生长（P<0.01）,且形状逐渐趋于一个完美的圆。免疫荧光染色可见类器官表达胆管上皮细胞标志物。在培养基中加入小分子CHIR-99021和Blebbistatin后,BrdU检测其增殖特性明显增高（P<0.01）。 结论 在体外能够成功培养获得了具有增殖能力的人胆囊类器官,其具有胆管上皮细胞的特性,可用于胆管疾病的研究与建模。     

雌性11β⁃HSD1敲除小鼠肠道类器官体外研究

目的：研究雌性11β?HSD1敲除小鼠肠道类器官功能改变。方法：分离年龄性别匹配的C57BL/6J小鼠和11β?HSD1敲除小鼠的肠道组织。细胞流式定量分析肠道上皮层干细胞、祖细胞、潘氏细胞分别所占比例。实时定量PCR检测干细胞和潘氏细胞的标志基因表达情况。分离小鼠肠上皮隐窝单位进行体外3D类器官培养,观察类器官增殖率及类器官分化程度。免疫荧光染色研究小肠类器官干细胞及潘氏细胞的定位和定量。结果：11β?HSD1敲除小鼠与野生组相比,其小肠上皮所含潘氏细胞数显著增高,干细胞数目无明显差异,祖细胞数目增多,肠道干细胞标志基因Lgr5在小肠上皮的表达有增高趋势。同时在大肠上皮组织中有类似的结果,11β?HSD1敲除组大肠干细胞、祖细胞数目及Lgr5基因表达均增高。体外研究结果显示,小肠隐窝成类器官比例有增高趋势,11β?HSD1敲除组增殖分化出的类器官对比野生组具有更复杂的结构及更多数目的类隐窝区域,但大肠隐窝类器官培养结果未见显著差异。对小肠类器官的干细胞及潘氏细胞染色发现,11β?HSD1敲除小鼠肠道类器官含有更多的潘氏细胞,干细胞数目亦有增多趋势。结论：11β?HSD1敲除后小鼠肠道细胞组成发生改变,在小肠上皮组织中,潘氏细胞数目显著增多;在大肠上皮组织中,干细胞、祖细胞数目及干细胞标志基因表达量均显著增加。体外研究显示,11β?HSD1敲除组小肠类器官包含更多的潘氏细胞,类器官具有更强的增殖及分化能力。     

小鼠小肠类器官体外培养体系的建立与应用

目的 建立一种研究肠上皮细胞的体外模型—小肠类器官培养体系，探索其相关病理检测技术方法，为肠道相关疾病的体外研究提供便利平台。方法 将小鼠肠上皮隐窝分离并培养成小肠类器官，体外模拟肠上皮的生长发育过程。通过制作石蜡切片，探索应用免疫组化技术以及基于基质胶中类器官三维水平免疫荧光技术对相应的增殖与分化信号进行检测。结果 探索并建立了小肠类器官体外培养体系，应用石蜡切片免疫组化技术与三维水平免疫荧光技术能够准确检测小肠上皮结构的生长发育状态。结论 小肠类器官体外培养体系的建立与免疫检测技术的应用，将逐渐使其成为人们研究肠道相关疾病最为有利的技术手段。     

免疫类器官在肿瘤免疫治疗中的研究进展

免疫类器官是一种体外3D培养模型。免疫类器官的出现推进了肿瘤免疫治疗的建模和精准医疗的转化应用。本综述旨在探讨免疫类器官的构建方法以及其在肿瘤免疫治疗中的潜在价值。